Szekciók

Sejtanalitika biofizikai megközelítéssel

Aug 27 - kedd

8:30 – 10:30

Elnök: Nagy Péter, Horváth Péter

08:30 – 08:50

Méhes Előd
Tumorsejtek angiogenezisre gyakorolt hatásának vizsgálata, in vitro

E2

Tumorsejtek angiogenezisre gyakorolt hatásának vizsgálata, in vitro

Méhes Előd1,2, Gulyás Márton1, Tárnoki-Zách Júlia1, Bilecz Ágnes2, Kovács Ildikó2,

Bugyik Edina3, Paku Sándor3, László Viktória4, Döme Balázs2,4, Czirók András1

1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Fizika Tanszék

2 Országos Korányi Pulmonológiai Intézet, Tumorbiológiai Osztály

3 Semmelweis Egyetem, I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet

4 Medical University of Vienna, Comprehensive Cancer Centre Vienna, Department of Surgery, Division of Thoracic Surgery

Tumorok progressziója, valamint a (kemo)irradiációs kezelésekre való érzékenysége függ a vérellátásuktól, ezért az érképződés vizsgálata a rákkutatás egyik fontos területévé vált. A tumort ellátó érrendszer kialakulása önszervező folyamat, vagyis a végleges struktúrát nem a szöveti környezet előmintázata határozza meg, hanem az érképző endothel sejtek és a tumorsejtek közötti kölcsönhatások. Az egyes érszegmensek növekedésében fontos szerepet játszik a kollektív sejtmozgás, amit autokrin/parakrin szekretált faktorok, a sejtközötti állomány mikromechanikája, valamint sejt-sejt kapcsolatok is befolyásolnak.

A malignus pleurális mesothelioma (MPM) egy agresszív daganattípus. Korlátozott kezelési lehetőségei miatt különösen rossz prognózissal rendelkezik, és nincsen ellene molekulárisan célzott terápia. MPM tumorok eltérő mennyiségben expresszálnak a semaphorin (Sema) fehérjecsaládhoz tartozó molekulákat, amelyeknek angiogenezisre gyakorolt különböző hatása ismert.

Létrehoztunk egy in vitro modellrendszert az angiogenezis kvantitatív elemzésére. Endothel sejtek aggregátumaiból kinövő ércsírák és térbeli ágrendszerük mikroszkópos képelemzésével, módosított Sholl-analízis segítségével vizsgáltuk az ércsíra képződést. Különféle MPM tumorsejtvonalakban megmértük különböző semaphorin altípusok expressziós mintázatát, és ezek alapján kiválasztottunk több sejtvonalat az in vitro tumor-angiogenezis vizsgálatához.

Videomikroszkópos (time-lapse) kísérletekben vizsgáltuk, hogyan hatnak az eltérő semaphorin expressziójú MPM tumorsejt szferoidok kokultúrában az endothel aggregátumokból induló ércsíra növekedésre. Az ércsíra ágrendszer térbeli alakulásának vizsgálatára tovább fejlesztettük a módosított Sholl-analízist. Segítségével kvantitatív elemzéseket végeztünk és kapcsolatot tártunk fel egyes semaphorinok szekréciója és az ércsíra növekedés térbeli szabályozása között. Ezzel párhuzamosan in vivo kísérleteket végeztünk MPM tumorsejtekkel beoltott egereken. A kialakult tumorok szövettani és immunhisztokémiai vizsgálatával alátámasztottuk, hogy az MPM tumorok érhálózatának kialakításában lényeges szerepet töltenek be a tumorsejtek által termelt semaphorinok.

08:50 – 09:10

Ungai-Salánki Rita
Egyedi sejtek manipulációja piezoelektromos mikropipettával

E3

Egyedi sejtek manipulációja piezoelektromos mikropipettával

Ungai-Salánki Rita 1,2,3, Francz Barbara2, Sautner Éva2, Horváth Róbert3 és Szabó Bálint1,2

1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Fizika Tanszék

2 CellSorter Műszaki Kutató és Fejlesztő Korlátolt Felelősségű Társaság

3 MTA EK Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézet, Nanobioszenzorika Csoport

Korábban kifejlesztettünk egy számítógépes látáson alapuló robotot [1], mely képes automatikusan felismerni és izolálni az egyedi sejteket szuszpenzióból az ezt követő DNS és RNS szekvenálás céljából. Az egyedi sejteket nanoliteres térfogatban tudtuk izolálni anélkül, hogy a szomszédos sejteket eltávolítottuk volna. Jelen munka az általunk kifejlesztett piezoelektromos mikropipetta alkalmazását mutatja be. A mikropipettában a folyadék fluktuációit két független módszerrel vizsgáltuk. Így igazoltuk a mikropipetta robosztus, nanoliter alatti (32 ± 8 pikoliter) folyadékkezelési pontosságát [2].

A piezoelektromos mikropipettát alkalmazva, lényegesen, ~75 %-ról 90 %-ra javult az egyedi sejt izolálási hatékonyság. Ez a javulás döntő fontosságú a ritka vagy értékes sejtek válogatásakor, különösen az orvosi alkalmazásokban. A kiváló minőségű fáziskontraszt megvilágításhoz a mikropipetta köré koncentrikusan elhelyezett LED gyűrűket alkalmaztunk. Így módszerünk teljesen automatizálható az élő sejtek fluoreszcens vagy fáziskontraszt megvilágítása mellett is. A piezoelektromos mikropipetta a hosszú műanyag csöveket és szelepeket is kiküszöböli, ami nagyságrendekkel precízebb folyadékkezelést tesz lehetővé.

Úgy gondoljuk, hogy a piezoelektromos mikropipetta hamarosan az orvosdiagnosztikai egy-sejt manipulációk új eszköze lehet keringő tumor sejtek izolálása, gyógyszer hatóanyagok tesztelése, egyedi sejtek mikroinjektálása, vagy reagensek pikoliteres-nanoliteres skálán történő kezelése céljából.

Köszönetnyilvánítás

A kutatási munka a Nemzeti, Fejlesztési és Innovációs Hivatal (PD 124559, KH_17, KKP 129936, ERC_HU és Élvonal), az MTA “Lendület” Program támogatásával valósulhatott meg.

Irodalom

[1] Ungai-Salánki R, Gerecsei T, Fürjes P, Orgovan N, Sándor N, Holczer E, et al. (2016) Sci Rep 6:20375.doi:10.1038/srep20375.

[2] Francz B, Ungai-Salánki R, Sautner É, Horváth R, Szabó B. Piezoelectric micropipette for automated single cell isolation (Beküldés előtt, 2019)

09:10 – 09:25

Kovács Kinga Dóra
Élő sejtek jelölésmentes vizsgálata optikai bioszenzorral áramlási térben egyidejűleg létrehozott széles áramlási sebességtartományban

E4

Élő sejtek jelölésmentes vizsgálata optikai bioszenzorral áramlási térben egyidejűleg létrehozott széles áramlási sebességtartományban

Kovács Kinga Dóra1, Novák Martin1 , Hős Csaba2, Szabó Bálint3, Székács Inna1, Bonyár Attila4 és Horváth Róbert1

1 MTA EK MFA Nanobioszenzorika Labor, Budapest

2 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Hidrodinamikai Rendszerek Tanszék, Budapest

3 Eötvös Loránd Tudományegyetem Biológiai Fizika Tanszék, Budapest

4 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Elektronikai Technológia Tanszék

Élő sejtek vizsgálata áramlási térben egy fontos területe a biofizikának, mivel így lehet vizsgálni az élő szervezeket ereiben fennálló körülményeket. Munkánkban egy olyan eszközt mutatunk be, ami jelölésmentes optikai bioszenzor segítségével (EPIC BT), nagy áteresztőképességgel képes nyomon követni a sejtekben lejátszódó változásokat áramlási tér hatására. Ez az eszköz lényegesen eltér az eddig ismert átfolyó küvettától illetve az úgynevezett ’plate and cone device’-tól: egy forgó mágneses tér segítségével tartott és forgatott mágneses keverőbot hozza létre az áramlást, így kikerülve a mechanikai összeköttetést a bioszenzor és a rotor között, jelentősen csökkentve a zajt.

Méréseinkben HeLa sejtek kitapadását és áramlás hatására bekövetkező lemosódását vizsgáltuk pll-g-peg/pll-g-peg-rdg funkcionalizált felületen. Fluidikai szimulációk segítségével vizsgáltuk a sejtek válaszát az áramlási sebesség, 0-1.16 m/s, függvényében.

Ezzel az új mérési elrendezéssel lehetséges lesz érfalsejteken hatóanyagok hatását vizsgálni áramlás alatt jelölésmentesen, illetve a különböző rákos sejtek áttétképzését részletesebben tanulmányozni.

09:25 – 09:40

Rehó Bálint
Magreceptorok mobilitásának és dimerizációjának vizsgálata élő sejtekben SPIM-FCCS és FRET segítségével

E5

Magreceptorok mobilitásának és dimerizációjának vizsgálata élő sejtekben SPIM-FCCS és FRET segítségével

Rehó Bálint1, Lukas Lau2, Mocsár Gábor1, Jan Wolfgang Krieger2, Jörg Langowski2, Tóth Katalin2, Vámosi György1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 German Cancer Research Center, Biophysics of Macromolecules

A magreceptorok szupercsaládjába olyan fehérjék tartoznak, amelyek ligandfüggő módon képesek szabályozni célgénjeik átírását. Kutatásunk során a retinoid receptorok családjába tartozó reténsav receptor (RAR) és a retinoid X receptor (RXR) kölcsönhatásait vizsgáljuk élő sejtekben. Működésüket a molekuláris kapcsoló modell írja le. Ezek a receptorok ligand hiányában DNS-hez kapcsolódva korepresszor komplexet kötnek és gátolják célgénjeik átíródását. A modell szerint agonista ligand hatására (az A vitamin származékai) a receptorok konformációváltozáson mennek keresztül, melynek során koregulátor csere történik és a korepresszor komplex aktivátor komplexre cserélődik. Ezt a modellt a területen zajló intenzív kutatások eredményeképp egyre dinamikusabb kép kezdi felváltani.

Vizsgálataink során arra voltunk kíváncsiak, hogyan változik a magreceptorok mobilitása és egymáshoz való affinitásuk ligand jelenlétében és hiányában.

Kísérleteink során HeLa sejtekbe transzfektáltunk fluoreszcens proteinekkel (GFP, mCherry) jelölt magreceptorokat. A mobilitásban bekövetkező változásokat fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) követtük nyomon. Heidelbergi kollaborációs partnereinknél fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiával (FCCS) kombinált Selective Plane Illumination Mikroszkópiai (SPIM) méréseket végeztünk(1). A sejtekről készült SPIM képeken FRET analízist is végrehajtottunk, hogy tovább növeljük méréseink információtartalmát.

Vizsgálataink kimutatták, hogy a receptorok mobilitása agonista ligand hatására csökken, valamint sikerült megmutatnunk azt is, hogy a két receptor kotranszfekciója ligand nélkül is a mobilitás csökkenéséhez vezet. Bebizonyítottuk továbbá, hogy egyes receptor-komplexek csak az egyik fél felől aktiválhatóak.(2)

SPIM-F(C)CS-el kombinált FRET vizsgálataink egy igen komplex rendszer képét kezdik kirajzolni, és segíthetnek feltárni a magreceptorok aktivációjában és dimerziációjában szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat.

Köszönetnyilvánítás

GINOP-2.3.2-15-2016-00026, DAAD #273478

Irodalom

[1] Krieger, J. W., Singh, A. P., Bag, N., Garbe, C. S., Saunders, T. E., Langowski, J., & Wohland, T. (2015). Imaging fluorescence (cross-) correlation spectroscopy in live cells and organisms. Nature Protocols, 10(12), 1948-1974.

[2] Brazda, P., Krieger, J., Daniel, B., Jonas, D., Szekeres, T., Langowski, J., Vamosi, G. (2014). Ligand Binding Shifts Highly Mobile Retinoid X Receptor to the Chromatin-Bound State in a Coactivator-Dependent Manner, as Revealed by Single-Cell Imaging. Molecular and Cellular Biology, 34(7), 1234-1245.

09:40 – 09:55

Lina Fadel
Impact of agonist treatment on RXR partner selection

E6

Impact of agonist treatment on RXR partner selection

Lina Fadel1, Laszlo Nagy2,3,4, György Vámosi1

1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, Debrecen, Hungary.

2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, Debrecen, Hungary

3UD-Genomed, Debrecen, Hungary.

4Departments of Medicine and Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine and Johns Hopkins All Children's Hospital, St. Petersburg, FL, USA. lnagy@jhmi.edu.

Retinoid X Receptor (RXR) plays a pivotal role as a transcription regulator. It serves as an obligatory heterodimerization partner for many other nuclear receptors (NRs). Activation of RXR heterodimers exert a transcriptional activity controlling a wide variety of important biological processes such as development, differentiation, metabolism and cell death. NRs share a common structure composed of several functional domains: an N-terminal transcription activation function domain; a DNA-binding domain; a flexible hinge region domain; and a C-terminal ligand binding domain. The mechanism of activation called molecular switch is also common between these receptors. In this study we intended to understand how the promiscuous RXR molecule behaves in the presence of several potential heterodimeric partners and ligands. We hypothesized that there is a competition between RXR partners for binding to RXR and binding of a specific agonist increases the affinity of a given receptor to RXR. Our hypothesis was tested with three partners of RXR: PPARγ, RAR,VDR using nuclear translocation assay in a three-color model system. The competition was evaluated detecting changes in heterodimerization between RXR and one of its partners, NR1, in the presence of another competing partner, NR2. Therefore, NR1 was needed in a form that is distributed evenly in the cell when expressed alone and enriched in the nucleus when interacting with RXR. These conditions were fulfilled by wt. VDR and mutant forms of both PPARγ and RAR lacking their NLS. Our data revealed that RXR binds to its unliganded partners with different affinities; highest for RAR, lowest for VDR and moderate for PPARγ while specific agonist treatment tips the scale in favor of the liganded partner.

This work was undertaken to a better understanding of RXR partition between its different heterodimeric and to obtain insight into triggering specific signaling pathway in complicating cellular environments.

09:55 – 10:10

Kovács Tamás
A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

E7

A dipólpotenciál mérése membránösszetétel-változással járó betegségek membránbiofizikai modellrendszereiben új áramlási citométeres módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1 Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A membrán dipólpotenciálja (DP) a lipidekhez asszociált interfaciális vízmolekulák, illetve a foszfolipidek és szterolok dipoláris szegmentumainak rendezett térbeli orientációjából ered. A dipólok elrendeződése révén ≈300 mV-os pozitív potenciál jön létre, amely a transzmembrán és felületi potenciáloknál jóval nagyobb intramembrán elektromos erőteret eredményez, befolyásolva a membránfehérjék konformációját és funkcióit. A DP nagyságát főleg a membrán lipidösszetétele, különösen a szterolok mennyisége határozza meg. Elhelyezkedése miatt mérése rendkívül nehéz, erre főleg a feszültségszenzitív di-8-ANEPPS fluorofórt használják spektrofluoriméteres vagy konfokális mikroszkópos excitációs arányméréses assay során. Ezen módszerek azonban jelentős hátrányokkal rendelkeznek, így célul tűztük ki egy új DP mérési módszer kifejlesztését.

Kísérleteink során egy újonnan leírt 3-hidroxiflavon-származék használatával kidolgoztunk és optimalizáltunk egy áramlási citometriás technikát a DP mérésére. Alkalmazásának alapja, hogy excitáció után a fluorofórban gerjesztett állapotú intramolekuláris proton transzfer reakció megy végbe. Az így kialakuló normál és tautomer forma emissziója elkülönül és mivel a két forma relatív előfordulása az intramembrán elektromos erőtér függvénye, a flurofór alkalmas a DP meghatározására emissziós arányméréses assay segítségével.

Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, di-8-ANEPPS-sel végzett spektrofluorimetriás referenciamérések mellett. JY lymphoblastoid és THP-1 monocita sejtekben kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7-dehidro-koleszterin tartalmának metil-β-ciklodextrin/szterol komplexekkel történő növelése dózisfüggő módon növeli a DP nagyságát.

A munkánk során optimalizált új áramlási citometriás módszer alkalmazható nagy mennyiségű élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére.

10:10 – 10:30

Rebenku István
A digitális patológia új lehetőségei: multispektrális konfokális fluoreszcenciás képalkotás

E8

A digitális patológia új lehetőségei: multispektrális konfokális fluoreszcenciás képalkotás

Rebenku István1, Bartha Ferenc2, Cameron B. Lloyd1, Szöőr Árpád1, Katona Tamás1, Molnár Béla3, Vereb György1

1 Debreceni Egyetem ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet;

2 Szegedi Tudományegyetem Bólyai Intézet;

3 Semmelweis Egyetem II, Belklinika; 3DHistech Kft.

A kvantitatív mikroszkópia a molekulák sejtbeli jelenlétének és lokalizációjának meghatározásától indulva változatos, fluoreszcencia-alapú modalitásokkal bővült, mint pl. konfokális 3D és multispektrális képalkotás, vagy molekuláris interakciók Förster rezonancia energia transzferen (FRET) alapuló in situ mérése. Ugyanakkor a digitális patológia gyors fejlődése mára lehetővé tette a mikroszkópiás sejtparaméterek szöveti kontextusban történő vizsgálatát, biztosítva a heterogenitás és ritka események felderítését.

A Pannoramic Confocal (3DHistech) az első digitális patológiai szkenner, mely a multiplex fluoreszcenciás detektálást nem csak konvencionális epifluoreszcenciás, de konfokális módban is lehetővé teszi. Munkánk során teszteltük a készülék pontosságát, linearitását és szenzitivitását, vizsgáltuk a dekonvolúció alkalmazhatóságát, valamint szövet szintű FRET méréseket implementáltunk.

Qifikit kalibrációs gyöngyök segítségével megállapítottuk, hogy 22.000 epitóp/gyöngy már detektálható a készülékkel. Az X-Y-Z irányú időbeli stabilitás és relokalizációs pontosság 100 nm-en belül volt. Elméleti modell hiányában a dekonvolúcióhoz kísérletileg határoztuk meg a különböző fényutakhoz tartozó rendszer PSF-ek katalógusát és verifikáltuk ezek mintasíkbeli homogenitását. A dekonvolúció az elvárt módon csökkentette a fókuszsíkon kívüli fotonforrások kontribúcióját és javította a finom struktúrák kivehetőségét. A FRET mérésre való alkalmazhatóság teszteléséhez immundeficiens egérben növesztett HER2+ tumorokon vizsgáltuk a HER2 homoasszociáció mértékét, a spektrálisan korrigált 3-szűrős kvantitatív módszert alkalmazva. A FRET értékek mind teljes látómezős, mind konfokális módban jól korreláltak a CLSM-ben mértekkel.

A Pannoramic Confocal digitális patológiai szkenner utat nyit a molekuláris interakciók és a fehérje-expressziós és morfológiai mintázatok szöveti szintű korrelatív vizsgálatához.

Köszönetnyilvánítás

A projektet a GINOP-2.2.1-15-2017-00072 pályázat támogatta.

Molekuláris biofizika

Aug 27 - kedd

11:00 – 13:00

Elnök: Vámosi György, Závodszky Péter

11:00 – 11:25

Kellermayer Miklós
A titin-miozin kölcsönhatás topológiája

E9

A titin-miozin kölcsönhatás topológiája

Kellermayer Miklós, Sziklai Dominik, Papp Zsombor, Brennan Decker, Lakatos Eszter és Mártonfalvi Zsolt

Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A titin a harántcsíkolt izom rugalmas tulajdonságait meghatározó legfontosabb fehérje. A titinmolekula a szarkomer Z- és M-csíkjai között húzódik. A titin funkcionális szempontból rugalmasan kontrahálódik illetve megnyúlik a szarkomer összehúzódása illetve passzív feszítése közben. Rugalmas alakváltozása mellett a titin meghatározó szerepet játszik a szarkomer szerkezeti integritásának fenntartásában. A szarkomer A-szakaszában a titin a miozin vastag filamentomokhoz asszociált, és így itt funkcionálisan rugalmatlan. A titin ismétlődő szerkezeti mintázata és a vastag filamentum periodicitása közötti hasonlóság alapján már régóta feltételezik, hogy a titin geometriai templátként szolgálhat a vastag filamentum felépülésében. Kísérleteinkben ezt a titin templát hipotézist teszteltük úgy, hogy a titint és miozint in situ sztöchiometriai arányban (300 miozin/12 titin) összekevertük változó ionerősség (100-300 mM) mellett, majd a kialakuló filamentumok és komplexek topológiai szerkezetét atomi erőmikroszkóppal (AFM) vizsgáltuk. Eredményeink szerint a titin és miozin filamentumok minden vizsgált kísérleti körülmény mellett szegregált populációt alkottak. Nem találtunk olyan asszociátumot, amelyben a miozin molekulák periódikusan helyezkednének el relaxált vagy megnyújtott egyedi titinmolekulák vagy titin oligomérek mentén. Ugyanakkor a titin oligomérek a miozin vastag filmentumok mentén kitapadtak és felületi hálózatot alkottak. Tehát, bár a titin nem geometriai templátja a miozin vastag filamentumnak, felületi hálózata fontos szerepet játszhat a miozin vastag filamentum in situ hosszának dinamikus szabályozásában.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatásával készült (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017)

11:25 – 11:45

Papp Ferenc
A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

E10

A feszültség-kapuzott Hv1 protoncsatorna VCF jelének eredete

Papp Ferenc, Pethő Zoltán, Bagosi Adrienn, Panyi György, Varga Zoltán

Debreceni Egyegyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A VCF (Voltage Clamp Fluorometry) technika egy nagyon hatékony módszer a membránpotenciál megváltozását érzékelni képes fehérjék konformáció-változásának a vizsgálatára. Ezt a technikát több labor már sikerrel alkalmazta feszültség-kapuzott ioncsatornák vizsgálatára, beleértve a Hv1-et is. Azonban csupán feltételezések vannak arra vonatkozóan, hogy mi is az oka annak, hogy a vizsgált fehérjéhez kapcsolt fluoreszcens festék által emittált fluoreszcencia intenzitásában változás történi a VCF-mérés során. A célunk az volt, hogy feltételezések helyett pontosabban meg tudjuk mondani, hogy a VCF jel mitől alakul ki, és ezáltal pontosabban megérthessük a vizsgált fehérje konformáció-változását.

A VCF méréseinket olyan Ci-Hv1 protoncsatornán végeztük, amelyben a 241-es pozícióban lévő Glu aminosav Cys-re van cserélve. Ehhez a Cys-hez kötődik az a Tamra-MTS fluoreszcens festék, amely érzékeny a lokális környezetére és ezáltal képes információt adni számunkra a fehérje konformáció-változásairól. Miután megvizsgáltuk a Hv1 csatorna aminosav-szekvenciáját, két lehetséges fluoreszcenciát kioltó aminosavat találtunk az extracelluláris oldalon. Ezeket Ala-ra mutáltuk és néztük, hogyan változik a VCF jelünk.

Bármelyik kioltó aminosavat mutáltuk Ala-ra (az Ala aminosav nem képes kioltani a fluoreszcenciát), kisebb VCF jelet mértünk. Ha mindkét fluoreszcenciát kioltó aminosavat elmutáltuk Ala-ra, semmilyen változást (jelet) nem voltunk képesek mérni. Ezek az eredményeink az jelzik, hogy a VCF jelünk kialakulásáért a Tamra-MTS festék közelében lévő fluoreszcenciát kioltó aminosavak a felelősek. További bizonyítékul szolgálhatna még, ha a fluoreszcenciát kioltó aminosavat másik, szintén kioltó aminosavra mutálnánk. Azonban már ezen ismeretek birtokában is elkezdtük egy modell kidolgozását, amelyben a legegyszerűbb, egyenes vonalú mozgását feltételezzük a Tamra festéknek a kioltó aminosavakhoz képest. Az előzetes modell-számításaink segítségével jól reprodukálhatók a mért eredményeink.

11:45 – 12:00

Padányi Rita
A CFTR fehérje NBD1 domén szerkezetének vizsgálata letekeredési útvonalak elemzésén keresztül

E11

A CFTR fehérje NBD1 domén szerkezetének vizsgálata letekeredési útvonalak elemzésén keresztül

Padányi Rita, Tordai Hedvig, Hegedűs Tamás

Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A cisztás fibrózis (CF) betegséget a CFTR fehérjében bekövetkező mutációk okozzák. A betegséget okozó mutációk nagy része, beleértve az 508-as fenilalanin delécióját (ΔF508) az N-terminális nukleotid-kötő doménben (NBD1) találhatók. A mutációk befolyásolhatják a domén-domén összeszerelődést, az NBD1 domén stabilitását és feltekeredését. A jelenlegi CF gyógyszerek a domén-domén összeszerelődést célozzák meg, de alacsony hatékonyságuk miatt újabban inkább a szerkezeti stabilitás növelése a cél. A CFTR érésének egyik első lépése a fehérje megfelelő feltekeredése, így a folding útvonalak pontos feltérképezése nélkülözhetetlen a hatékony CFTR terápia kidolgozásához.

Mivel a feltekeredést vizsgálni nehéz és a fel- és letekeredés során az egyes lépések reverzibilisek, munkánk során a vad típusú, illetve a ΔF508 mutáns NBD1 fehérje letekeredési útvonalait vizsgáltuk in silico módszerekkel illetve erőspektroszkópiás kísérletekkel. Molekuladinamikai szimulációval meghatározott intermedier állapotok két letekeredési útvonal mentén helyezkednek el. A folyamat egy közös szakasszal indul, majd a béta-szubdomén letekeredése után az alfa-alegység szerkezeti egységei eltérő sorrendben is letekeredhetnek. Az NBD1 fehérje letekeredésének in vitro vizsgálata során egyedi molekulákat nyújtottunk meg atomerőmikroszkóp (AFM) segítségével. A szerkezeti alegységek letekeredésének mintázata megfeleltethető volt az in silico módszerekkel kapott eredményeinknek. Azt a különbséget figyeltük meg, hogy az in vitro kísérletekben az alfa-szubdomén több mint két útvonalon tudott széthajtogatódni. Kiemelten fontos, hogy a ΔF508 mutációt tartalmazó és a vad típusú NBD1 a kitekeredés során más-más arányban járták be az egyes útvonalakat.

Eredményeink hozzájárulnak a vad típusú és a ΔF508 mutáns NBD1 domén szerkezeti és dinamikai különbségeinek pontosabb megértéséhez.

12:00 – 12:15

Bukovics Péter
Szerkezet-funkció koordináció gelsolin homológ fehérjékben

E12

Szerkezet-funkció koordináció gelsolin homológ fehérjékben

Bukovics Péter1, Gaszler Péter1, Rauan Sakenov1, Pintér Réka1, Huber Tamás1, Bugyi Beáta1

1 Pécsi Tudományegyetem, Biofizikai Intézet

A Gelsolin Homológ (GH) domén család fehérjéi központi szerepet játszanak az aktin citoszkeleton szabályozásában. A hat GH-domént tartalmazó gelsolin (GSN) egy Ca2+-aktiválta multifunkcionális aktin szabályozó fehérje. A közelmúltban azonosították a Flightless-I-et (Fli-I), melyet szintén hat GH-szegmens jellemez, ám ehhez kapcsolódik egy leucin-gazdag ismétlődés. Mind a GSN, mind a Fli-I szerepet játszanak különböző patológiai folyamatokban (szepszis, szöveti regeneráció). Bár a Ca2+-függő aktiválás tekintetében a GSN szerkezeti-funkcionális viszonyai jól ismertek, a Ca2+ Fli-I aktin-aktivitásában betöltött szerepe tisztázatlan. Funkcionális vizsgálataink azt mutatják, hogy a GSN és a Fli-I GH16 doménjei Ca2+ hatására különböző módon reagálnak, ami a két fehérje eltérő konformációs jellemzőit feltételezik. Munkánk során a GSN és a Fli-I szerkezeti viselkedését vizsgáltuk Ca2+ jelenlétében és hiányában fluoreszcencia spektroszkópia és biokémiai módszerek alkalmazásával.

Ca2+ jelenlétében a Trp fluoreszcencia paramétereinek változása a GSN-ben fluoreszcencia kioltás vizsgálatoknál, illetve kémiai denaturációt követően markáns konformációs változásokra utal, mely összhangban van a GSN aktivációjának nagyfelbontású szerkezeti modelljével. Ezzel szemben eredményeink arra utalnak, hogy a Fli-I GH16-ban lévő Trp-ok mikrokörnyezete különbözik a GSN-étől, még Ca2+-mentes környezetben is, így azt jelentően nem befolyásolja a kation jelenléte. A spektroszkópiai adatokat a GSN és a Fli-I GH16 esetében a limitált proteolízisnél megfigyelt különböző kinetikai jellemzők is alátámasztják. Kísérleti eredményeinket bioinformatikai elemzésünk is megerősíti, amely rámutat, hogy a II-es típusú Ca2+-kötő helyek és a C-terminális farok, melyek a GSN Ca2+-indukálta szerkezeti változásaiért felelősek, nem konzerváltak a Fli-I GH16-ban. Összességében munkánk során különböző Ca2+-függő válaszokat tárunk fel, melyek a GSN és a Fli-I eltérő aktiválási módjait jelzik.

12:15 – 12:30

Feller Tímea
Amiloid β-peptid hatása a fibrinháló szerkezetére és lízisére

E13

Amiloid β-peptid hatása a fibrinháló szerkezetére és lízisére

Feller Tímea, Hársfalvi Jolán, Csányi Csilla, Kiss Balázs és Kellermayer Miklós S.Z.

Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet, Budapest

Az Alzheimer kór neurodegeneratív betegség, melyben fontos vaszkuláris komponens is jelentkezik. Az agyi erekben nem csak a kórra jellemző amiloid peptidek, hanem fibrinogén felhalmozódása is megfigyelhető. Amiloid jelenlétében a fibrinogénből kialakuló alvadék mechanikai és morfológiai tulajdonságai is megváltoznak, a kialakult fibrinháló lízise is gátlódik. Az emésztésnek ellenálló alvadék elzárja a véráram útját, gyulladást indukál és további neurovaszkuláris károsodáshoz vezet.

Az amiloid β-peptid neurotoxikus fragmense az Aβ25-35. Ezen fragmensből csillámfelszínen epitaxiálisan növesztett amiloid szálakat állítottunk elő fibrinogén jelenlétében. Az amiloid szálak környezetében megfigyelhető a fibrinogén monomerek felhalmozódása.

Amiloid jelenétében csillámfelszínen alvasztott fibrinháló mikrostruktúráját atomi erőmikroszkópiával (AFM) vizsgáltuk. A háromdimenziós hálóból egy kvázi kétdimenziós struktúrát hoztunk létre. Az egyedi szálak átlagos magasságát és szélességét vizsgáltuk, mely 20 μM amiloid jelenlétében szignifikánsan csökkent (magasság 18,0 nm (±5,09 nm) 21,8 nm (±5,47 nm) helyett, szélesség 122,7 nm (±28,4 nm) 141,7 nm (±32,5 nm) helyett).

Az alvadék mechanikai tulajdonságait a munkacsoportunk által kifejlesztett nanoreológiai méréssel, a nano-trombelasztográfiával (nTEG) vizsgáltuk. Amiloid jelenlétében az alvadás folyamán végig nagyobb maximális erőkülönbség értékeket mértünk. Ebből az egyedi fibrinszálak megnövekedett Young-modulusára következtethetünk.

Összességében amiloid peptid jelenlétében kisebb szálakból felépülő fibrinháló alakul ki. A kisebb szálakra megnövekedett merevség jellemző, amit nTEG méréseink megnövekedett erőkülönbség-értékei alátámasztanak.

Köszönetnyilvánítás

A kutatása az alábbi programok támogatásával készült:

Az orvos-, egészségtudományi- és gyógyszerészképzés tudományos műhelyeinek fejlesztése (EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00009)

Új Nemzeti Kiválósági Program (ÚNKP-18-3-IZ-SE-12)

Nemzeti Szívprogram (NVKP-16-1-2016-0017)

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

12:30 – 12:45

Farkas Enikő
A glyphosate gyomirtószer-hatóanyag élettani hatása MC3T3-E1 sejtek adhéziójára

E14

A glyphosate gyomirtószer-hatóanyag élettani hatása MC3T3-E1 sejtek adhéziójára

Farkas Enikő1,2, Orgován Norbert3, Székács András4, Horváth Róbert1, Székács Inna1

1Magyar Tudományos Akadémia, Energiatudományi Kutatóközpont, Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézet, Nanobioszenzorika Momentum Csoport

2Pannon Egyetem, Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori Iskola (Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskola)

3Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológiai Fizika Tanszék

4Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ, Agrár-Környezettudományi Kutatóintézet

A világszerte használt növényvédőszer-hatóanyag a glyphosate biztonságos használatával kapcsolatban számos kérdés merült fel, mivel bizonyos toxikus hatásokkal hozták összefüggésbe (pl.: csontvelői, magzati, embrionális és placentális sejtvonalakon). Ezért ennek a szernek a sejtadhézióra gyakorolt élettani hatását vizsgáltuk Epic BT bioszenzorral, a sejtes folyamatokat jelölésmentesen és valós időben monitorozni képes szenzorikai eljárással.

Epic BT alkalmazásával kidolgoztunk receptorspecifikus sejtletapadási vizsgálatokat, lehetővé téve integrin–ligandum-interakciók kvantitatív karakterizálását élő sejtekben [1]. Modellként a legkisebb ismert természetes diszintegrint, az echistatint választottuk ki az integrin által közvetített sejtadhézió gátlására. Az új módszert alkalmazva az echistatin gátlási koncentráció félértékét (IC50) az élő HeLa sejtekben 20-40 nM tartományban határoztuk meg, ami összhangban van a szakirodalmi adatokkal.

Továbbá a glyphosate integrinkötődési folyamatokra gyakorolt célzott hatását és sejtadhéziós modulációs effektusát figyeltünk meg és tártuk fel Epic BT optikai bioszenzor segítségével. Kimértük különböző koncentrációjú glyphosate-oldattal bevont felületeken a MC3T3-E1 sejtek adhéziós kinetikáját, ahol azt tapasztaltuk, hogy a glyphosate alacsony koncentráció esetén (0,1%) az RGD-motívumhoz hasonlóan serkenti, míg magasabb koncentráció alkalmazásával gátolja a sejtek letapadását a szenzorfelületre.

Különböző koncentrációjú glyphosate-oldatokkal is vizsgáltuk az integrinblokkoló hatást. Megállapítottuk a glyphosate IC50 értéket 20,6 mM. Illetve az RGD-specifikus integrinek (MC3T3-E1 sejtekben) és az oldatban lévő glyphosate közötti háromdimenziós disszociációs konstansát számítottuk ki, amelyre 0,352 mM értéket kaptunk, míg az RGD-specifikus integrinek az RGD-motívumhoz mutatott affinitására 5,97 µM-t.

Köszönetnyilvánítás

Magyar Tudományos Akadémia „Lendület Program”, NKFIH (ERC_HU, KH_17, NVKP_16-1-2016-0049 és KKP_19) és OTKA K109865.

Irodalom

[1] I. Szekacs et al. (2018) Sens Actuators B-Chem 256: 729–734.

12:45 – 13:00

Kanyó Nicolett
Rákos sejtek adhéziójának vizsgálata optikai bioszenzorral: a glikokálix enzimatikus emésztésének hatásai

E15

Rákos sejtek adhéziójának vizsgálata optikai bioszenzorral: a glikokálix enzimatikus emésztésének hatásai

Kanyó Nicolett, Székács Inna, Horváth Róbert

MTA EK MFA Nanobioszenzorika Lendület Kutatócsoport

Az élő sejtek adhéziója központi szerepet játszik számos életfolyamatban. A rákos sejtek terjedésében a sejtadhéziós folyamatok meghatározó szerepet töltenek be [1]. Sejtadhéziós molekulák közé tartoznak az integrinek. Az integrinek fő funkciója a sejt-extracelluláris mátrix közötti kapcsolat kialakítása. Egyes integrinek az RGD tripeptiddel kölcsönhatva indítják el a sejtadhéziós folyamatot. Ez a mechanizmus nagyban függ a kapcsolódási felületen lévő RGD-motívumok számától, elhelyezkedésétől, egymástól mért átlagos távolságától [2].

A glikokálix szinte valamennyi sejttípusra, köztük a rákos sejtekre is jellemző sejtfelszíni cukorréteg, amely nagyban befolyásolja a sejtek kölcsönhatását a környezetükkel. A glikokálix az integrin rendszer viselkedésében és a sejtek szignalizációban feltételezhetően erős, de részleteiben nem tisztázott szabályozó funkciót lát el. A glikokálix adhézióban betöltött szerepe meglehetősen ellentmondásos, egyes helyeken az adhéziót növelő, máshol viszont csökkentő szerepéről számolnak be.

A sejtadhézió valós idejű, kvantitatív követésére napjainkban kezdenek elterjedni a felületérzékeny optikai bioszenzorok, mint pl. a rezonáns rácsos hullámvezető (RWG) technológia. Az RWG típusú bioszenzorok közé tartozik a Corning Epic® BenchTop (Epic BT) műszer is. Az Epic BT kiemelkedő előnye a nagy áteresztőképesség és felületi érzékenység, a műszer képes biológiai folyamatok valós idejű követésére is, ezért az adhézió kinetikáját segítségével nagy precizitással detektálhatjuk. [3].

Kutatómunkánk során különböző RGD-motívum sűrűségűszintetikus polimer felületeket alakítottunk ki, melyeken HeLa sejtek adhéziós kinetikát mértük. A létrehozott felületeken meghatároztuk a sejtek integrinjei és a felület RGD-motívumai közötti kötés disszociációs állandójáta glikokálix egyes komponenseit emésztő enzimmel kezelt és kezeletlen esetben is. A kezelések hatására az integrin-RGD kötés erősödését tapasztaltuk. Megállapítottuk továbbá, hogy a glikokálix elemek eltávolítása nemcsak az adhézió mértékét csökkenti, de a sejtek kezelésére használt enzimkoncentráció növelésével az adhézió sebessége is csökken. A látszólag egymásnak ellentmondó eredményeink magyarázatára egy egyszerű biofizikai modellt állítottunk fel a glikokálix szabályozó funkcióját illetően.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük, Dr. Deli Mária Annának és Dr. Dér Andrásnak a kutatási téma megindításában a csoportunknak nyújtott értékes segítségét, a hasznos megbeszéléseket

Irodalom

[1] Mackay, C. R., & Imhof, B. A. (1993) Immunology today 14(3), 99-102.

[2] Orgovan, N., Peter, B., Bősze, S., Ramsden, J. J., Szabó, B., & Horvath, R. (2014) Scientific reports 4, 4034.

[3] Peter, B., Ungai-Salanki, R., Szabó, B., Nagy, A. G., Szekacs, I., Bősze, S., & Horvath, R. (2018) ACS omega 3(4), 3882-3891.

Membránok, membránfehérjék biofizikája

Aug 27 - kedd

15:00 – 17:00

Elnök: Bóta Attila, Varga Zoltán

15:00 – 15:20

Hegedűs Tamás
Az ABCG2 fehérje regulációjának és transzport mechanizmusának in silico felderítése

E16

Az ABCG2 fehérje regulációjának és transzport mechanizmusának in silico felderítése

Hegedűs Tamás

Semmelweis Egyetem, Bioizikai és Sugárbiológiai Intézet

Az ABCG2 (az ATP Binding Cassette szupercsalád G2-es tagja, más néven Breast Cancer Resistance Protein, BCRP), egy farmakológiailag jelentős transzmembrán fehérje, amely kulcsfontosságú biológiai barrierekben és gyógyszert metabolizáló szervekben fejti ki működését. Számos kémiailag különböző szerkezetű vegyületet képes szubsztrátként felismerni és a sejtből kipumpálni, így jelentősen befolyásolja gyógyszermolekulák farmakokinetikáját. Szerepet játszik őssejtek xenobiotikumoktól való megvédésében és rákos sejtek kemoterápiás szerekkel szemben mutatott rezisztenciájában is. Az ATP-függő transzportfolyamatot jelentősen befolyásolja a koleszterin jelenléte. A koleszterin általi szabályozásnak és magának a transzportnak az atomi felbontású részletei még nem ismertek. Ezeket a folyamatokat kísérletesen nehéz vizsgálni, ezért megértésükhöz molekula dinamikai módszereket alkalmaztunk. Vizsgálatainkat az tette lehetővé, hogy a közelmúltban a fehérje több konformációjának szerkezetét is meghatározták krio-elektronmikroszkópiával. Mikroszekundumos időskálájú molekuladinamikai szimulációkat hajtottunk végre a fehérje apo és ATP kötött szerkezetével szubsztrát (húgysav) jelenlétében illetve hiányában, POPC illetve POPC/koleszterin lipid-kettősrétegbe ágyazva. A koleszterin jelenléte nem befolyásolta a fehérje egyensúlyi dinamikáját, ami arra utal, hogy ez a molekula az ABCG2 átmeneti állapotán fejti ki hatását. Szimulációinkban meg tudtuk figyelni a húgysav mozgását az általunk prediktált szubsztrátkötő helyek között [1]. A szubsztrát extracelluláris tér felé történő transzlokációja még a hosszú MD szimulációkban sem történt meg, ezért a lehetséges átjutási útvonalakat metadinamikai szimulációkkal írtuk le. Eredményeink várhatóan hozzájárulnak a fehérje működésének és a szubsztrátfelismerés mechanizmusának megértéséhez.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük az NKFIH (K 111678 és K 127961), KIFÜ HPC erőforrások és az MTA Wigner GPU laboratórium támogatását.

Irodalom

[1] Laszló L, Sarkadi B, Hegedűs T (2016) PLoS One 11:e0164426.

15:20 – 15:40

Mihály Judith
Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

E17

Extracelluláris vezikulák IR spektroszkópiája

Mihály Judith, Bebesi Tímea, Kitka Diána, Szentirmai Veronika, Szigyártó Imola Csilla, Bóta Attila, Varga Zoltán

MTA Természettudományi Kutatóközpont, Anyag- és Környezetkémiai Intézet

Az extracelluláris vezikulák (EV-k) az utóbbi években kerültek a tudományos érdeklődés középpontjába: ismertté vált, hogy a sejtek foszfolipid kettősréteggel határolt nanoméretű struktúrákat, ún. extracelluláris vezikulákat bocsájtanak ki, amelyek jelentős szerepet játszanak a sejtek közötti intercelluláris kommunikációban. Bár az EVk kiemelkedő lehetőséggel bírnak, mint betegségmarkerek vagy gyógyszerhordozók, klinikai alkalmazásukhoz szükség van a megfelelő észlelési és jellemzési módszerek kidolgozására. Az infravörös (IR) spektroszkópia – standardizált mérési körülmények és adatfeldolgozási eljárásokkal kiegészítve – egy egyszerű, jelölésmentes módszer lehet EV-k jellemzésére. Bár főként az egyedi vezikulák jellemzésére alkalmas technikák fejlesztése került előtérbe (AFM, lézercsipeszes Raman spektroszkópia), mind orvosdiagnosztikai szempontból, mind a biokémiai jelenségek tanulmányozása céljából szükség van olyan gyors, mintaelőkészítés nélküli módszerekre, amelyek az EVk egy-egy sokaságát tudják specifikusan jellemezni.

A jelen munka során vörösvértestkoncentrátumokban (VVT) ex vivo keletkező EVket (mikrovezikulákat) vizsgáltunk IR spektroszkópiai módszerrel. Az alkalmazott ATR FT-IR technika, valamint a spektrumokból számolt fehérje-lipid arány egy robosztus karakterizálási eljárásnak bizonyult különböző jellegű EV minták megkülönböztetésére. A fehérjék másodlagos szerkezetére, illetve orientációjára utaló IR markerek szintén megfelelő „ujjlenyomatot” szolgáltatnak. A kapott eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy bár az alapkutatásban a VVT-eredetű EVket, mint modell-vezikulákat alkalmazzák, ezek minőségére hatással vannak a vörösvértestkoncentrátumok tárolási körülményei (tárolási idő, tárolási adalék). A vérkészítményekben az öregedés/tárolás során keletkező és felgyülemlő EVk - gyulladás-indukáló hatásuk miatt - károsan befolyásolhatják a vérkészítmények további felhasználhatóságát; az IR spektroszkópia alkalmas lehet ezen EVk gyors jellemzésére.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NVKP_16-1-2016-0007 pályázat anyagi támogatásával végeztük.

15:40 – 16:00

Szántó G Tibor
Feszültségfüggő K+ csatornák gátlásának specifikus mechanizmusa: peptid gátlószerek és a C-típusú inaktiváció kölcsönhatása

E18

Feszültségfüggő K+ csatornák gátlásának specifikus mechanizmusa: peptid gátlószerek és a C-típusú inaktiváció kölcsönhatása

Szántó G Tibor1, Panyi György1, Izhar Karbat2 és Eitan Reuveny2

1 Debreceni Egyetem ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science, Izrael

A feszültségfüggő ioncsatornák nagy affinitású és specifikus gátlószerei a peptid gátlószerek, melyek lehetnek az ioncsatornák pórusába kötődő pórus gátlószerek, illetve az ioncsatornák feszültség érzékelő doménjéhez kötődő, így az ioncsatorna kapuzását módosító gátlószerek.

A kollaborációs partnerünk által végzett molekuláris dinamikai szimulációk a gátlás mechanizmusának egy új lehetőségét feltételezik, amely szerint bizonyos peptid gátlószerek a feszültségfüggő ioncsatornák inaktivációs kinetikáját befolyásolják, mivel kölcsönhatásba lépnek az ioncsatornák szelektivitási szűrő mögötti régiójában („inaktivációs üreg”) található lokális vízhálózattal, az ún. "inaktivációs vízmolekulákkal”. Célunk ilyen speciális peptid gátlószerek (pl. Cs1 – Cone Snail toxin) hatásmechanizmusának leírása, továbbá a számításokkal összhangba hozható kísérletes bizonyítékok feltárása.

A Cs1 gátlószer ioncsatornákra gyakorolt hatását patch-clamp technikával, feszültség-zár üzemmódban, outside-out konfigurációban végeztük több, eltérő sebességgel, de lassú, ún. C-típusú inaktivációt egyaránt mutató, Shaker-IR típusú feszültségfüggő káliumcsatornán. Eredményeink szerint az extracellulárisan alkalmazott Cs1 csökkentette az áramamplitúdót (az egyensúlyi blokk néhány másodperc alatt kialakult), míg szignifikánsan növelte az ioncsatornák inaktivációs időállandóját, de nem volt hatása az ioncsatornák aktivációs kinetikájára és a félaktivációs feszültség értékére. A toxin hatás nem mutatott feszültség függést.

Mindezen eredmények alátámasztják a Cs1 gátlószer specifikus kötődési mechanizmusát, egyúttal rávilágítanak az inaktivációs üregben található szerkezeti vízmolekulák C-típusú inaktiváció stabilizációjában betöltött szerepére is. Továbbá a Cs1 és hasonló peptidek alkalmazása nagy jelentőségű lehet az inaktiváció tanulmányozásában, mivel egy új gátlási mechanizmussal rendelkező peptid molekula megnyithatja az utat újabb, eddig kis sikerrel megcélzott ioncsatornák működésének modulálásához.

16:00 – 16:15

Kenesei Ádám
Interleukin-15 transz-prezentáció tanulmányozása fluoreszcencia mikroszkópiával

E19

Interleukin-15 transz-prezentáció tanulmányozása fluoreszcencia mikroszkópiával

Kenesei Ádám1, Szalóki Nikoletta1, Hegedűs Éva1, Volkó Julianna1, Waldmann Thomas A.2, Vámosi György1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 National Institutes of Health Lymphoid Malignancies Branch

Interleukin-15 (IL-15) citokin jelentős szerepet játszik a természetes és adaptív immunrendszer szabályozásában. A szintézis fő helyszínei a dendritikus sejtek és monociták. Az IL-15 receptor (IL-15R) három alegységből (IL-15Rα, IL-2/15Rβ, γc) épül fel. Az IL-15 elsősorban transz-prezentáció útján biztosítja a jelátvitelt. Professzionális antigén prezentáló sejtek (APC-k) - amelyek expresszálják az IL-15-öt és az azt megkötő IL-15Rα alegységet – prezentálják a ligandot a célsejten jelenlévő β és γc alegységeknek. Felvetődik a kérdés, hogy az APC antigént kötő fő hisztokompatibilitás komplexe (MHC II) és a T sejten elhelyezkedő T sejt receptor (TCR) kölcsönhatása révén lejátszódó antigén-felismerés szerepet játszik-e a transz-prezentációban. Ennek tanulmányozásához az IL-15Rα-t stabilan kifejező Raji B-sejtvonalat, valamint a β és γc alegységeket kifejező Jurkat T-sejtvonalat használtunk. Ha a Raji sejteket Staphylococcus Enterotoxin E szupernatigénnel (SEE) kezeljük, az SEE-t kötő MHC II molekula stabil immunológiai szinapszist alakít ki a Jurkat sejten lévő TCR-rel, így tanulmányozhatóvá válik az MHC II-TCR interakció hatása az IL-15 transz-prezentációra. A transz-prezentáció kimutatására Förster rezonancia energia transzfer (FRET) méréseket végeztünk a β és α alegységek között. Az IL-15Rα mCherry fluoreszcens fehérjével jelölt formában (N-terminálison) expresszálódik a Raji sejteken, az IL-2/15Rβ alegységet Alexa488-Mikβ3 antitesttel jelöltük. A FRET mérések közvetlenül bizonyítják az IL-2/15Rβ és IL-15Rα alegységek összeszerelődését transz-prezentáció során. Az alegységek közt mérhető FRET megnőtt az MHC II-TCR interakció hatására. Transzprezentáció során mind az IL-15Rα, mind az IL-2/15Rβ alegység feldúsul a szinapszisban, azonban SEE és IL-15 szimultán kezelés hatására ez a feldúsulás kisebb mértékű.

16:15 – 16:30

Mocsár Gábor
Fehérjeklaszterek T sejtek membránjában és blebjein

E20

Fehérjeklaszterek T sejtek membránjában és blebjein

Mocsár Gábor1, Zubánics-Nagy Áron1, Volkó Julianna1, Tóth Katalin2, Waldmann Thomas A. 4, Wieser Stefan3, Vereb György1, Schütz Gerhard3, Bodnár Andrea1, Vámosi György1

1 Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

3Institute of Applied Physics, Vienna University of Technology

4Lymphoid Malignancies Branch, National Cancer Institute, Bethesda, USA

A membránfehérjékből felépülő sejtfelszíni struktúrák változatos térbeli és időbeli szerkezettel rendelkeznek, több hierarchikus szinten szerveződnek. Az immunfolyamatokban fontos szereppel rendelkező interleukin-2 és -15 citokin receptorok és az MHC I és II molekulák közös klaszterekben fejeződnek ki T sejtek membránjában. Tápanyag megvonás hatására a sejteken apoptotikus/nekrotikus membrán hólyagok, blebek alakulnak ki, a nagyméretű blebek membránja nem rendelkezik citoszkeletális kapcsolatokkal, azokat citoszkeleton mentes modellmembránnak használtuk.

Kísérleteinkben arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a citoszkeleton hiánya, a fehérjék mobilitásának a növekedése, illetve a membrán mikrodomén szerkezetének megváltozása a blebeken hogyan hat az MHC I, MHC II, valamint az IL-2Rα és IL-15Rα- alegységek klaszterméreteire, homo- illetve heteroasszociációjára, a fehérje-fehérje kölcsönhatások stabilak maradnak-e a citoszkeleton hiányában.

Az ép sejtfelszínen, illetve a blebek felszínén a receptorok és molekulák klaszterméreteinek meghatározását szuperfeloldású STED képek analízisével végeztük el. A közös komplexekben levő fehérjék arányát fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiával vizsgáltuk meg. A fehérjék homo- és heteroasszociációit többcsatornás fluoreszcencia intenzitásmérésen alapuló mikroszkópos FRET méréssel jellemeztük.

Méréseink szerint, 40 nm-es feloldás mellett, a blebek felszínén fehérjeeloszlások homogének, nem volt jele magasabb szintű szerveződésnek, illetve mikrodomének jelenlétének. A mérési eredmények alapján megállapítható, hogy a fehérjék aránya a közös komplexekben, valamint ezen fehérjeasszociációk stabilitása független a citoszkeletonnal való kapcsolattól és a magasabb szerveződésű sejtmembrán eltűnésétől.

16:30 – 16:45

Volkó Julianna
Új intracelluláris jelátviteli mechanizmus? Interleukin receptor összeszerelődés az ER-ben és a Golgi-ban

E21

Új intracelluláris jelátviteli mechanizmus? Interleukin receptor összeszerelődés az ER-ben és a Golgi-ban

Volkó Julianna1, Kenesei Ádám1, Mocsár Gábor1, Várnai Péter2, Tóth Katalin3, Waldmann Thomas A.4, Vámosi György1

1 Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Semmelweis Egyetem, ÁOK, Élettani Intézet

3German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

4NIH, CCR, Lymphoid Malignancies Branch, Bethesda MD, USA

Az interleukin-2 és -15 citokinek központi szerepet töltenek be az immunrendszer szabályozásában, kontrollálva a limfociták túlélését és apoptózisát, meghatározó jelentőségűek különböző leukémiákban és autoimmun betegségekben. Heterotrimer receptoraik a sejtmembránban ligandspecifikus, saját α-alegységekkel rendelkeznek, ugyanakkor a jelátvivő β- és γc-láncokat közösen használják. A sejtfelszínen kifejeződő receptor láncokat célzó anti-IL-2Rα (daclizumab) terápiákkal, melyek a T sejt proliferáció gátlására irányulnak, csekély siker érhető el felnőttkori T sejtes leukémiában (ATL) és sclerosis multiplex-ben. Kiváncsiak voltunk, vajon az IL-2R alegységek képesek-e összeszerelődni így hatékony jelátvitelt lehetővé tenni már az endoplazmatikus retikulumban (ER) és/vagy a Golgi-ban, mielőtt a sejtfelszínre jutnak.

Az EGFP vagy mCherry fluoreszcens fehérjével jelölt receptor láncok összeszerelődését a szekréciós úton (az ER és a Golgi területén) élő HeLa sejtekben vizsgáltuk konfokális mikroszkópiás intenzitás-alapú Förster rezonancia energia transzfer (FRET) mérések segítségével.

Az ER-ben és a Golgi-ban is sikerült energiatranszfert mérni a β- és a γc-, valamint a β- és az IL-2Rα- ill. IL-15Rα alegységek között. Az IL-2Rα heteroasszociációját az IL-15Rα-val és a γc-láncok homoasszociációját szintén kimutattuk ezekben a sejtorganellumokban. A β-IL-2Rα/IL-15Rα és az IL-2Rα-IL-15Rα heteroasszociációkat jellemző energiatranszfer hatásfokok szignifikánsan magasabbak voltak a plazmamembránban, mint az ER-ben vagy a Golgi-ban, ami arra utal, hogy a szekréciós út során történő részleges asszociáció után, az alegységek összeszerelődése a sejtfelszínen fejeződik be.

IL-2-termelő T sejtekben a jelátvitel végbemehet az ER/Golgi-ban előre összeszerelődött receptorok által. Eredményeink rávilágíthatnak az intracelluláris autokrin jelátvitel egy új paradigmájára ill. magyarázatot adhatnak a sejtfelszíni receptorokat célzó antagonista antitest terápiák rezisztenciájára.

16:45 – 17:00

Zákány Florina
Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

E22

Membránszterolok és -ceramidok támadáspontjának meghatározása feszültségkapuzott káliumcsatornákon voltage-clamp fluorometry (TEVCF) módszerrel

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A feszültségkapuzott káliumcsatornák (Kv) egy feszültségszenzor (VSD) és egy pórusdoménből (PD) épülnek fel. A VSD felelős a membránpotenciál érzékeléséért, míg a PD az ionok számára átjárható pórust alakítja ki. Ismert, hogy a membrán koleszterin (hiperkoleszetrinémia, Smith-Lemli-Opitz szindróma), illetve ceramid (Gaucher-kór) tartalmának növelése befolyásolja a Kv csatornák több kapuzási paraméterét. A kísérletek során azt határoztuk meg, hogy ezek a lipidek melyik doménen keresztül hatva fejtik ki elektrofiziológiai hatásaikat, a VSD vagy a PD az elsődleges célpontjuk.

A fenti betegségek membránbiofizikai modelljeinek kialakításához Xenopus laevis oociták membránját töltöttünk metil-béta-ciklodextrin-koleszterin vagy -7-dehidrokoleszterin komplexekkel, valamint C16-ceramiddal, illetve C16-glikozilceramiddal. Az elektrofiziológiai méréseket TEVCF módszerrel végeztük, ami a patch-clamp mérésekkel szemben az ionáramok meghatározásával egyidőben lehetővé teszi a VSD mozgásának monitorozását a VSD extracelluláris részének MTS-TAMRA fluoreszcens festékkel történő jelölését követően. Így egyszerre kapunk információt a PD (G-V görbe, áramkinetika) és a VSD (F-V görbe, fluor. jel kinetika) állapotáról a kapuzási folyamat alatt, ezáltal nemcsak a fent említett lipidek ionáramra gyakorolt elektrofiziológiai hatásai, hanem azok ioncsatornán belüli célpontja (VSD vagy PD) is azonosíthatóvá válnak. A VSD-PD közti csatolás vizsgálatoz az eltérő csatolási mechanizmussal bíró Kv1.3 és Kv10.1 csatornákon végeztük el a kísérleteinket.

Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a szterolok elektrofiziológiai hatásaikat a Kv csatornák PD-jén keresztül fejtik ki. Ezzel szemben a C16-glikozilceramid és C16-ceramid más támadásponttal rendelkezik, méréseink alapján előbbi a PD-n, utóbbi a VSD-n keresztül fejti ki hatását. A ceramidok támadáspontjának további vizsgálatához a két VSD-ből felépülő feszültségkapuzott protoncsatornán (Hv1) tervezünk hasonló méréseket.

Köszönetnyilvánítás: ÚNKP-18-3-IV-DE 54

I. Poszterszekció (P1-P31)

Aug 27 - kedd

17:00 – 19:00

Hollósi Anna
BRAF szerepe az endotél sejtek mechanikájában

P7

BRAF szerepe az endotél sejtek mechanikájában

Hollósi Anna1, Pászty Katalin1, Debreczeni Márta2, Cervenak László2, Kellermayer Miklós1, Manuela Baccarini3, Guillaume Charras4, Varga Andrea1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet, Budapest

2 Semmelweis Egyetem, III. sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest

3 Bécsi Egyetem, Max. F. Perutz Laboratories

4 Londoni Nanotechnológiai Központ, London

A vérerek falát alkotó endotél sejtek számos módon hozzájárulnak a tumorok fenntartásához. A tumor metasztázis képzése során a véráramba bekerülő tumorsejtek az endotél sejt-sejt kapcsolatok megbontásával jutnak el a metasztázis képzés helyére. E folyamat molekuláris mechanizmusa kevéssé ismert. Korábbi, endotél BRAF knockout egerekkel végzett kísérleteink rámutattak e fehérje endotél sejt-sejt kapcsolatok dinamikájában betöltött szerepére: BRAF hiányában a sejtkapcsolatok megerősödnek, amely együtt jár a permeabilitás csökkenésével, valamint a melanoma sejtek kisebb mértékű transzmigrációjával in vitro és extravazációjával in vivo. Az endotél sejtek nemcsak biokémiai, hanem mechanikai hatásoknak is kitettek. A rákos sejtek áthaladását az érfalon az endotél sejtek sejtfelszíni adhéziós molekulái érzékelik és ez specifikus biológiai választ vált ki bennük. Kutatásunk során célul tűztük ki az endotél sejtek különböző nagyságú mechanikai erők által kiváltott biológiai válaszának jellemzését. Célunk megvalósításához egy speciális módszert alkalmazunk, amely lehetővé teszi az endotél sejtréteg megnyújtását. A sejtréteg megnyújtása hatására bekövetkező aktin citoszkeleton átrendeződésével járó folyamatok jellemzésére a cofilin és a miozin könnyű lánc foszforilációjának megváltozását követtük a sejtréteg 20 és 30%-os megnyújtásánál. Aktin és miozin könnyű lánc fluoreszcens jelölésével valós időben is követtük a megnyújtás hatására bekövetkező lokalizációs változásokat. A kísérleteket elvégeztük BRAF csendesített sejtrétegen is. Eredményeink alapján a miozin könnyű lánc foszforilációja már kisebb megnyúlásoknál bekövetkezik, míg a cofilin foszforilációja csak nagyobb mértékű megnyúlásnál növekszik jelentős mértékben. Megnyújtás hatására az aktin és a miozin könnyű lánc átrendeződése következik be, amely a megfeszülő sejt-sejt kapcsolatok stabilizálását célozza.

Köszönetnyilvánítás

A munkát a Semmelweis Egyetem Elméleti és Transzlációs Orvostudományok Doktori Iskola (H.A.), Semmelweis Egyetem Start-up Grantje (2018, V.A.) és a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatta (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017).

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Haluszka Dóra
Glikált kollagén fibrillumok atomierő-mikroszkópiás vizsgálata

P6

Glikált kollagén fibrillumok atomierő-mikroszkópiás vizsgálata

Haluszka Dóra1, Hársfalvi Jolán1 és Kellermayer Miklós1

1 Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A biológiai szövetekben az I-es típusú kollagén a leggyakoribb szerkezeti fehérje, az extracelluláris mátrix legfőbb építőköve. Különösen nagy mennyiségben fordul elő a bőrben, csontokban, ínakban és az erek falában. Szerkezetére hierarchikus felépítés jellemző. Általánosságban a kollagének tropokollagén alegységekből épülnek fel, amelyekből három egymás köré csavarodva tripla helikális konformációt vesz fel, és ezek összetettebb szerkezetű rostokat hoznak létre.

Munkánk során egy gyakori, a kollagén szerkezeti deformációját okozó patofiziológiai folyamatra, a glikációra fókuszáltunk. A glikáció nem-enzimatikus, több lépésben zajló, végül irreverzíbilissé váló folyamat, amely a redukáló cukrok (glükóz, fruktóz, ribóz) és fehérjék aminocsoportjai között játszódik le, majd előrehaladott glikációs végtermékek (AGE) képződéséhez vezet. Korábbi kísérletünkben a másodharmonikus keltés módszerével (SHG) igazoltuk, hogy a szöveti glikáció a kollagén rostok degradációját okozza, azonban rejtve maradt, hogy a glikáció befolyásolja-e a kollagénszálak szerkezetét és mechanikai tulajdonságait [1].

Kísérleteinkben humán placentából izolált I-es típusú kollagén fibrillumok glikációját vizsgáltuk atomierő-mikroszkópiával (AFM). A glikációt 0,5 M ribóz oldattal indukáltuk 37 C°-on 5, 10 és 15 napon keresztül. Az egyedi fibrillumok topológiai szerkezetének vizsgálatát az AFM non-kontakt módjában végeztük, majd az egyedi szálak rugalmassági modulusát nanoindentációs erőgörbék felvételével határoztuk meg. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a hiperglikémiás körülmények a kollagén fibrillumok szerkezeti és mechanikai tulajdonságainak szignifikáns változásához vezetnek.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatásával készült (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017)

Irodalom

[1] Haluszka D, Lőrincz K, Kiss N, Szipőcs R, Kuroli E, Wikonkál NM (2016) Biomed Opt Express 7: 4480-4489.


A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Halász Henriett
Membrán nanocsövek transzport tulajdonságainak vizsgálata szuperrezolúciós mikroszkópiával

P5

Membrán nanocsövek transzport tulajdonságainak vizsgálata szuperrezolúciós mikroszkópiával

Halász Henriett1, Ghadaksaz Ali Reza1, Madarász Tamás1, Nyitrai Miklós1,3, Matkó János2 és Szabó-Meleg Edina1,3

1 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi kar, Biofizikai Intézet

2Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Intézet,

3Pécsi Tudományegyetem, Szentágothai János Kutatóközpont

A membrán nanocsövek (NT) aktin vezérelt, „csőszerű” sejtnyúlványok. Kulcsfontosságú szerepet töltenek be a távoli sejtek közötti gyors és hatékony anyagtranszport folyamatokban. Feladatukat, felépítésüket és biológiai szerepüket tekintve rendkívül sokszínűek. Az NT-k sejtorganellumok (mitokondrium, lizoszóma), nukleinsavak (DNS, RNS) szállítása mellett szerepet játszanak baktériumok és vírusok terjesztésében. Továbbá tumorok progressziójában, kemoterápiás szerekkel szembeni rezisztencia továbbadásában, illetve idegrendszeri eredetű betegségek (pl.: Alzheimer-kór) kialakulásáért felelős fehérjék szállításában is részt vesznek. Az NT-k kialakulását számos sejttípusban leírták in vitro, de egyre több adat áll rendelkezésünkre in vivo előfordulásukról is. Habár az NT-k sejtek közötti kommunikációban betöltött szerepe többé-kevésbé jól ismert, az ezeket a folyamatokat irányító mechanizmusok és az anyagtranszportban részt vevő motorproteinek nem ismertek.

Munkánk során az adaptív humorális immunválasz kialakításában fontos, antigén prezentáló tulajdonságokkal is rendelkező B-limfociták NT-inek transzport tulajdonságait vizsgáltuk strukturált megvilágítású mikroszkóp alkalmazásával, ugyanis a B sejtek közötti NT-k fontos jelentőséggel bírhatnak a hatékony immunválasz kialakításában. Elősorban az NT-ken keresztül megvalósuló vezikuláris transzportot, és az abban részt vevő motorfehérjéket jellemeztük. Továbbá megvizsgáltuk a CD86 kostimulátor fehérje NT-ben való transzportját [1, 2].

Eredményeink alapján a B sejtek NT-i által közvetített erőteljes vezikuláris transzport aktin-miozin rendszer függő, és a sejtek képesek immunkostimulátor fehérjék NT-ken keresztül történő átadására, amely serkentheti az immunrendszer működését.

Vizsgálataink hozzájárulhatnak az NT-k terápiás célú alkalmazását célzó kísérletek eredményéhez.

Irodalom

[1] Osteikoetxea –Molnar A et.al. (2016) Cell Mo Life Sci 73: 4531-4545.

[2] Halász H et.al (2018) Methods Appl Fluoresc 6(4):045005.

Dudás Bálint
Aktív RalF azonosítása és vizsgálata a Molecular Dynamics with Excited Normal Modes módszer segítségével

P4

Aktív RalF azonosítása és vizsgálata a Molecular Dynamics with Excited Normal Modes módszer segítségével

Dudás Bálint1,2, Francois Perous3, Jacqueline Cherfils3, David Perahia3, Balog Erika1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Inézet, Budapest

2 Pázmány Péter Katolikus Egyetem, ITK, Budapest

3 Laboratoire de Biologie et de Pharmacologie Appliquée, Ecole Normale Supérieure Paris-Saclay, Párizs

Az Arf GTPázok a lipid- és membránforgalom legjelentősebb szabályozói. A nyugalmi állapotban lévő sejtben GDP-kötött állapotukban találhatóak meg. A sejt agonista gerjesztésének hatására GEFek (guanin kicserélő faktorok) közreműködésével a kötött GDP GTP-re cserélődik. Ennek eredményeként az Arf aktivált membránkötött konformációt ölt és specifikusan további effektorokkal hat kölcsön.

A célsejt meghódítása érdekében és annak megsemmisítése ellen a bakteriális károkozók effektor fehérjéket injektálnak a gazdasejt citoszoljába, melyek sokszor kis GTPázok eltérítő szabályozóiként működnek. A legionella pneumophilia, a baktérium, mely súlyos tüdőgyulladást okoz (Legionárius betegség) nagy mennyiségű effektort injektál a célsejtbe. Ezek átalakítják a membránforgalmat és létrehoznak egy vakuólumot (membránnal határolt üreget), ahol a baktérium elrejtőzhet és osztódhat. Egyik ilyen effektor a RalF fehérje, amely eltéríti a gazdasejt Arf1 fehérjéjének normális működését.

A citoszolban a RalF fehérje autoinhibitált állapotban van jelen és jelentős szerkezeti változáson kell átesnie, hogy elérje a membrán-kötött aktivált konformációt. Az MDeNM (Molecular Dynamics with Excited Normal Modes) módszer alkalmazásával prezentáljuk a RalF autoinhibitációból való feloldásának mechanizmusát és membrán-kötött aktivált konformációját.

A mechanizmust az MDeNM módszerrel való konformációs feltérképezés, majd ennek az eredményének kísérleti adatokon alapuló szűrése révén fedjük fel. Kutatásunkban megjelenik a RalF két aktivációs állapotának összehasonlítása, az aktivációban kulcs fontosságú aminosavakat beazonosítjuk.

A GEF-szerű RalF és kis GTPáz Arf1 fehérjék közötti kölcsönhatási minta is feltárásra kerül, mindkét félben a kulcsfontosságú aminosavak beazonosításával.

Zolcsák Ádám
A fotoszenzibilizáció membránkárosító hatásának vizsgálata atomierő-mikroszkóppal

P31

A fotoszenzibilizáció membránkárosító hatásának vizsgálata atomierő-mikroszkóppal

Zolcsák Ádám, Bozó Tamás, Kósa Nikoletta, Bőcskei-Antal Barnabás, Csík Gabriella, Voszka István, Herényi Levente

Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológia Intézet

A fotodinamikus terápia (PDT) jelenleg már az első vonalban szereplő terápiák között is megtalálható kezelési lehetőség. Az eljárás alapját az alkalmazott fényérzékenyítők (leggyakrabban porfirinek) besugárzására képződő reaktív oxigén származékok (ROS) sejtkárosító hatása jelenti. A ROS több helyen okozhat károsodást a sejteken belül, így a membránlipidekben is. A karásító hatás eléréséhez az egyik alapfeltétel az, hogy az alkalmazott fényérzékenyítő molekula a kívánt sejtekben feldúsuljon. Ha ez megtörtént, akkor szelektív hatás érhető el a megfelelő hullámhosszú megvilágító fény és szöveti oxigén jelenlétében.

Modelrendszerként DPPC és DOPC lipidek keverékéből felületasszociált kettősréteget hoztunk létre csillámfelületen kis unilamelláris liposzómák inkubációjával. Fényérzékenyítőként pedig mezoporfirin-dimetil észtert alkalmaztunk. Az így nyert membránrendszert atomierő-mikroszkóppal (AFM) vizsgáltuk fehér fénnyel történő megvilágítás előtt és után.

Elsőként mintáink topológia változásait tanulmányoztuk AFM képalkotás segítségével. A kettősrétegek mechanikai tulajdonságainak változásait pedig „erőspektroszkópiai” mérésekkel követtük nyomon. Ezeket a méréseket szintén AFM-el végeztük. A méréseinkhez kontrolként csak DPPC-t tartalmazó kettősrétegeket alkalmaztunk, amelyekben korábbi tapasztalataink szerint a ROS képződés ellenére sem történik károsodás.

Az AFM képeken jól észlelhető különbségeket figyelhettünk meg: míg a telített lipidmembránok megvilágítás után is intaktak maradtak, a telítettlen lipideket is tartalmazó mintáinkban kisméretű lyukak keletkeztek. A „erőspektroszkópia” során a membránok nanomechanikai ujjlenyomatának tekinthető átszakadási erőket rögzítettük. Első eredményekként azt kaptuk, hogy a DPPC és DOPC lipidek keverékéből készített membránokban az átszakadási erők a megvilágítás hatására szisztematikusan csökkentek.

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.


Zákány Florina
Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

P30

Ciklodextrinek membránbiofizikai és Kv1.3 ioncsatornára kifejtett direkt hatásainak karakterizálása

Zákány Florina1, Kovács Tamás1, Sohajda Tamás2, Szente Lajos2, Nagy Péter1, Panyi György1, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 CycloLab Cyclodextrin R & D Laboratory Ltd., Budapest

A ciklodextrinek (CD) hat (αCD), hét (βCD), illetve nyolc (γCD) alfa-D-glükopiranóz-egységből álló ciklikus oligoszacharidok. Alakjuk belül üreges, hidrofób csonkakúp, így képesek gyógyszermolekulákkal és különböző lipidekkel komplexeket képezni. Széles körben alkalmazzák őket gyógyszerekben semleges vivőanyagként, illetve a kutatásban a membrán koleszterintartalmának szelektív csökkentésére (metil-β-ciklodextrin; MβCD). A ciklodextrinek ioncsatornákra kifejtett direkt hatásait korábban nem vizsgálták. Mivel a feszültégkapuzott káliumcsatornák (Kv) számos biológiai folyamatot kontrollálnak, a CD-ek ezen csatornákra gyakorolt direkt hatásaik révén szerepet játszhatnak számos gyógyszer ismert mellékhatásainak kialakításában (pl.immunszupresszió).

Célunk az MβCD, valamint három különböző inverz (hat, hét vagy nyolc 3,6,-anhidroglükózból álló, belül hidrofil, kívül hidrofób) ciklodextrin (iαCD; iβCD; iγCD) direkt ligand hatásainak karakterizálása Kv1.3-on, illetve annak alátámasztása, hogy ez a ligand hatás független a CD-ek koleszterin depletáló és/vagy membránbiofizikai paramétereket módosító képességétől.

A direkt hatások vizsgálatához a patch-clamp méréseket Kv1.3 ioncsatornával es EGFP-vel kotranszfektált CHO sejteken végeztük. A CD-ek 1 és 5 mM-os koncentrációban részben reverzibilsen gátolták a Kv1.3 ionáramot (MβCD< iαCD< iγCD), kivéve az iβCD, aminek nem volt ilyen hatása. A membránbiofizikai mérések során 1 órás inkubációt követően megvizsgáltuk a CD-k hatását a membrán fluiditásra, hidrációra, rendezettségre, illetve kolorimetriásan meghatároztuk a koleszterin kivonás abszolút mértékét. A CD-k közül egyedül az MβCD-nek volt koleszterin depletáló és membránfizikai hatása, az iCD-knek nem.

Ezek alapján elmondható, hogy a CD-knek a membrán koleszterintartalom módosításától független, eddig le nem írt direkt gátló hatással is bírnak a Kv ioncsatornákra, amelynek fontos szerepe lehet a belőlük készült gyógyszerek mellékhatásainak kialakításában.


Csányi Csilla
Multimer glikoprotein AFM vizsgálata: elektrosztatikus kölcsönhatások szerepe

P3

Multimer glikoprotein AFM vizsgálata: elektrosztatikus kölcsönhatások szerepe

Csányi Csilla1, Feller Tímea1, Kellermayer Miklós1, Hársfalvi Jolán1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A vérkeringés legnagyobb multimer glikoproteinje, a von Willebrand faktor (VWF). A globuláris VWF érsérüléskor, nagy sebességgradiensű helyeken kinyúlik, kriptikus kötőhelyek válnak szabaddá a szubendoteliális kollagén pozitív- és a trombocita GPIbα receptor negatív helyeihez való kötődésre, így közvetíti a trombocita adhéziót. Patológiás esetben intakt endotélhez is közvetíti az adhéziót heparán szulfáthoz kötődve.

Célom atomi erő mikroszkóppal (AFM) vizsgálni, hogy különböző elektrosztatikus tulajdonságú felszínekhez kötött VW multimer morfológiája eltérő-e.

Módszer: plazma készítményből tisztítottam a VWF-t heparin affinitás kromatográfiával. 7,4 vagy 6,0 pH-jú PBS-sel 1ng/ul-re hígított oldatából 10ul-t cseppentettem negatív töltésű csillámpalára vagy pozitív töltésű poli-L-lizinnel (PLL) bevont csillámpalára. 1 percig inkubáltam, 18 MΩ*cm tisztaságú vízzel mostam, N2-vel szárítottam. Cypher AFM-mel, AR14 programmal, AC módban analizáltam a felszíneket.

A VW multimerek PLL felszínen gyöngyhalmaz, csillám felszínen a gyöngysor struktúrát mutattak. A struktúrák (n~1000) alakját területük körterülethez viszonyított arányával (kör-arány) számszerűsítettem. Minél közelebb van egyhez a szám, a gyöngyhalmaz annál inkább kör területű. Minél közelebb van nullához a szám, a gyöngysor annál fonálszerűbben terül el. Eredményeim táblázatba foglalva:

Kör-arány
medián (IQD)

Csillámpala

PLL

pH 7,4

pH 6,0

pH 7,4

pH 6,0

0,48
(0,33-0,67)

0,51
(0,36-0,67)

0,60
(0,43-0,76)

0,66
(0,50-0,79)

Az AFM képek alapján a VW multimer a negatívan töltött csillámpalán fonálszerű, míg a pozitív töltésű PLL-en inkább körszerű struktúrát vesz fel pH 7,4-en. Ismert, hogy a Golgiban (pH 6,0-on) a VW multimer kompakt szerkezetű. Ilyen pH-jú oldatból a VW multimer morfológiája csillámpalán hasonló a pH 7,4-en látszóhoz, míg PLL-en kompaktabb körszerű. Csillámpala és pH 7,4 megfelelőbb a multimer vizsgálatára.

Köszönetnyilvánítás

Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017

Zákány Florina
Ioncsatornák Gaucher-kórban megfigyelhető funkcionális eltéréseinek vizsgálata a betegség in vitro modellrendszerében

P29

Ioncsatornák Gaucher-kórban megfigyelhető funkcionális eltéréseinek vizsgálata a betegség in vitro modellrendszerében

Zákány Florina1, Székelyhidi Virág1, Panyi György1, Kovács Tamás1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

Számos makrofág funkcióban (citokin szekréció, migráció, fagocitózis, NO szintézis) felvetették ioncsatornák (így a Kv1.3, BK, KCa3.1, Hv1 vagy TRPM2) funkcionális szerepét, illetve ismert, hogy a sejtmembránban található lipidek befolyásolják az ioncsatornák működését. Így feltételezhető, hogy az elsősorban a makrofágok kóros működésével, valamint a lizoszomális béta-glükocerebrozidáz enzim deficienciája révén a glikozilceramid felhalmozódásával jellemezhető Gaucher-kórban az ioncsatornák eltérései jelentősek lehetnek a betegség patomechanizmusában, amelyet korábban még nem vizsgáltak. Ezért célunk egy olyan modell kialakítása, amellyel a későbbiekben vizsgálni tudjuk, hogy Gaucher-kórban milyen, ioncsatornákkal összefüggésbe hozható makrofág funkciók sérülnek.

Modellünk kialakítása során THP-1 monocitákat, belőlük differenciáltatott M0, illetve klasszikus (M1), alternatív (M2a) és regulatórikus (M2r) útvonalakon aktivált makrofágokat kezeltünk a betegségben deficiens enzim irreverzibilis gátlószerével, konduritol-B-epoxiddal (CBE), amelynek hatására a szubsztrát glükozilceramid felhalmozódása figyelhető meg előbb a lizoszómák, majd egyéb intracelluláris organellumok membránjában, illetve a sejtmembránban. A különböző koncentrációkban alkalmazott CBE hatására kialakuló enzimgátlás mértékét kolorimetriás módszerrel határoztuk meg, majd áramlási citometria és megfelelő antitestek segítségével meghatároztuk a CBE kezelés hatására a sejtmembrán ceramid és glükozilceramid tartalmában bekövetkező eltérések nagyságát, validálva modellrendszerünket a későbbi funkcionális mérések számára. Differenciációs és aktivációs protokolljaink áramlási citometriával történő tesztelése és optimalizálása után megvizsgáltuk különböző ioncsatorna gátlószerek (TEA, Vm24, paxilline, TRAM-34, ClGBI és flufenamát sav) hatását az eltérő útvonalakon aktivált makrofágok életképességére. Kísérleteinket a fenti ioncsatornák szerepének vizsgálatával folytatjuk különféle makrofág funkciók esetén.

Köszönetnyilvánítás

ÚNKP-18-3-IV-DE 54


Vörös Orsolya
Az Orai1 ioncsatorna immunológiai szinapszisba történő berendőzédésének molekuláris háttere

P28

Az Orai1 ioncsatorna immunológiai szinapszisba történő berendőzédésének molekuláris háttere

Vörös Orsolya1, Panyi György1, Hajdu Péter2

1 Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen

2 Debreceni Egyetem, FOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen

A CRAC csatornáknak kiemelt szerepe van a T-limfocita aktivációhoz szükséges Ca2+ jel kialakításában. A CRAC csatorna két szerkezeti egységből épül fel: az ER membránjában található STIM1-ből és a plazmamembránbeli Orai1-ből; melyek a T-sejt APC-vel történő találkozása során kialakuló immunológiai szinapszisban (IS) felhalmozódnak. Továbbá ismert, hogy aktin-kötő fehérjék (HS1/WASp/WAVE2) - melyek felelősek lehetnek az ioncsatornák IS-beli kihorgonyzásáért - az IS-ben feldúsulnak, valamint géncsendesítésük gátolja az IS kialakulását és a Ca2+- függő jelátviteli útvonalat a T sejtben. Ezek alapján feltételezzük, hogy az aktin-kötő fehérjék részt vesznek a CRAC csatorna kihorganyzásában az IS-ben, mely fontos a megfelelő Ca2+-jel kialakításához a T-sejt aktiváció során.

GST affinitás kromatográfiát alkalmazva kimutattuk, hogy a HS1, amely egy aktin-regulátor fehérje, képes kötődni az Orai1 csatorna N-terminálisához. Az mGFP-vel jelölt, vad típusú illetve különböző N-terminális deléciós mutáns (Orai1-N1-74: 1-74, Orai1-N2-88: 1-88) csatornákat stabilan expresszáló Jurkat T sejteket CD3-CD28 beaddel konjugáltatva immunológiai szinapszist hoztunk létre, majd különböző időpillanatokban (1, 5, 15, 30, 60 perc) meghatároztuk az Orai1 és a HS1 IS-beli feldúsulását és kolokalizációját. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy hasonlóan a vad típusú Orai1 csatornához, az Orai1 N-terminális rövidebb szakaszának eltávolítása (Orai1-N1-74) esetén az Orai1 továbbra is képes a HS1-gyel kolokalizálódni az IS-ben a T sejtekben, azonban a feldúsulás mértéke alacsonyabb illetve lassabb kinetikát mutat a vad típusú csatornához képest. Az N-terminális nagyobb részének eltávolítása (Orai1-N2-88) során az Orai1 IS-beli feldúsulása elmaradt, és nem mutatott HS1 kolokalizációt.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az Orai1-HS1 interakció szerepet játszik az Orai1 csatorna IS-beli kihorganyzásában amely befolyásolhatja a Ca2+ -jel kialakulását a T-sejt aktivációja során.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az NKFIH-K128525, ÚNKP-18-DE-149, NKFIH-K119417, GINOP-2.3.2-15-2016-00044, EFOP-3.6.2-16-2017-00006, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00009 támogatta.

Török Ferenc
A Pterinochilus murinus venom hatása feszültség függő nátrium és kálium ioncsatornákra

P27

A Pterinochilus murinus venom hatása feszültség függő nátrium és kálium ioncsatornákra

Török Ferenc1, Tanya Kushwahaa1,2, Török Enikő3, Papp Ferenc1,2, Panyi György2, Hajdu Péter1,2

1 Debreceni Egyetem ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Debreceni Egyetem FOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

3 Debreceni Egyetem ÁOK, Humángenetika Tanszék

Az elmúlt pár évtizedben a gyógyszertervezés során előtérbe kerültek az állatfajok (kígyók, skorpiók, pókok) által szekretált peptidek, mint lehetséges templátok. Jelen projektünkben a kenyai Usambara-hegységben elterjedt Pterinochilus murinus madárpók által termelt méreg (PMCV) ioncsatornákra kifejtett farmakológiai hatását vizsgálatuk meg.

A vizsgálatok során kb. 20 darab, 3-4 éves egyed került havi szinten fejésre, ezzel biztosítva számukra a megfelelő exkréciós időtartamot. A méreg kinyerése TENS készülékkel történt, majd a mérget liofilizáltuk és felhasználásig -20 C-on tároltuk. Az ioncsatornák áramát patch-clamp technikával teljes-sejt vagy outside-out konfigurációban határoztuk meg. Az ioncsatornákat HEK-293 sejteken expresszáltattuk.

Eredményeink azt mutatták, hogy a 0.1 mg/ml koncentrációban alkalmazott PMCV az Nav1.3 és Nav1.5 nátrium ioncsatorna inaktivációs kinetikáját lassította, viszont az áramamplitúdót nem módosította. Továbbá az Nav1.4 csatornát működését nem befolyásolta a PMCV. Ezzel szemben a Kv2.1 kálium csatorna áramát gátolta a PMCV, viszont a kapuzási paramétereket nem befolyásolta.

Jövőbeni terveink között szerepel a méreg HPLC-n történő frankcionálása, majd az aktív frakciók azonosítása. Funkcionális vizsgálataink során a toxinok akciós potenciálra kifejtett hatását fogjuk meghatározni.

Köszönetnyilvánítás:

NKFIH-K128525, ÚNKP-18-DE-149 és Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (H.P.), NKFIH-K119417 (P.Gy.), EFOP-3.6.1-16-2016-00022 (P. F. és T.F.)

Tajti Gábor
Ioncsatorna expressziós eltérések vizsgálata in vitro polarizált T-sejteken

P26

Ioncsatorna expressziós eltérések vizsgálata in vitro polarizált T-sejteken

Tajti Gábor1, Szántó G. Tibor1, Csóti Ágota1, Rácz Gréta1, Bagosi Adrienn1, Paholcsek Melinda2, Tolnai Emese2, Panyi György1

1 Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Debreceni Egyetem ÁOK, Humángenetikai Tanszék

A T-sejtek memória funkciójuk szerinti ioncsatorna (Kv1.3, KCa3.1) expressziós különbségei régóta ismertek [1], azonban az kevéssé ismeretes, hogy a T-helper-Treg altípusok között milyen eltérések fedezhetők fel. Állatkísérletes adatok utalnak különbségekre [2], humán vizsgálatok eddig azonban nem ismeretesek. Révén, hogy számtalan betegség patofiziológiájában kiemelt szerepűek egyes T-sejt altípusok, célul tűztük ki ezen sejtek ioncsatorna expressziójának jellemzését, esetleges terápiás célpontok azonosítása céljából.

Vizsgálatainkhoz egészséges önkéntesek véréből CD4+ T-sejteket izoláltunk, melyeket polarizáló citokin-aktivátor környezetben Th1 és Treg irányba differenciáltattunk. A sejtpopulációkat tovább dúsítottuk mágneses bead alapú eljárásokkal, majd patch-clamp és Kalcium imaging technikákkal jellemeztük azok ioncsatornáit, továbbá génexpressziós vizsgálatokat végeztünk (RT-qPCR).

Előzetes eredményeink alapján a Kv1.3 funkcionális expressziója szignifikánan magasabb a Th1 sejtekben a Treg-hez viszonyítva (914/sejt vs. 260/sejt), a KCa3.1 szintje nem mutatott ilyen különbségeket (62/sejt vs. 42/sejt). A Kv1.3 csatorna biofizikai paraméterei (aktivációs és inaktivációs időállandók, V1/2, stb) nem különböztek. Génexpressziós szinten is felfedezhetők különbségek, a Th1 esetén a T-bet, míg a Treg esetén a FOXP3 transzkripciós faktorok a várt emelkedett expressziót mutatják, azonban az ioncsatorna gének jellemzése további adatelemzést kíván.

További terveink között szerepel a kalcium imaging mérések elemzése, mellyel a kalcium homeosztázis különbségeit kívánjuk jellemezni, valamit további T-sejt altípusok vizsgálata (Th2, Th17). Eddigi eredményeink alapján felfedezhetők expressziós különbségek a T-sejt altípusok ioncsatorna repertoárjában, mely lehetőséget adhat azok terápiás kihasználására.

Köszönetnyilvánítás

GINOP-2.3.2-15-2016-00015 I-KOM TEAMING.

Irodalom

[1] Wulff et al., J.Clin.Invest., 2003, 111:1703-1713

Szendi-Szatmári Tímea
A fluorofór szaturáció hátrányos hatásának csökkentése FRET mikroszkópos mérések során

P25

A fluorofór szaturáció hátrányos hatásának csökkentése FRET mikroszkópos mérések során

Szendi-Szatmári Tímea1, Szabó Ágnes1,2, Szöllősi János1,2, Nagy Péter1

1Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2MTA-DE Sejtbiológiai és Jelátviteli kutatócsoport

A Förster rezonancia energia transzfer a világon széles körben elterjedt, és alkalmazott biofizikai mérő módszer. Méréseink során vizsgáltuk a fluorofór szaturáció hatását az intenzitás alapon számolt FRET hatékonyságra. Konfokális mikroszkópiában a magas numerikus apertúrájú objektív fókuszpontjában a gerjesztő fény intenzitása olyan magas, hogy a fluorofórok fluoreszcenciája szaturálódik. Tehát levonható az a következtetés, hogy az emittált fény intenzitása nem nő egyenesen arányosan a gerjesztő fény intenzitásával. Ez a jelenség megkérdőjelezi a kvantitatív fluoreszcenciás vizsgálatok pontosságát, illetve a FRET hatékonyság félrebecsléséhez vezethet. Azért, hogy bizonyítsuk a szaturáció hatását, sejteket jelöltünk olyan antitestekkel, amik az ErbB2 sejtfelszíni fehérje két különböző epitópjára specifikusak. A jelölést követően a különböző lézerintenzitások mellett felvett mikroszkópos képeken hetero-FRET értékeket számoltunk. Az eredményeink azt mutatták, hogy a FRET értékek csökkentek a donor gerjesztő lézer növekvő intenzitásainak függvényében. Munkánk során bemutatunk egy olyan módszert, ami megszünteti a FRET hatékonyság magas gerjesztő fénytől való függését, és hozzájárul a fehérje-fehérje kölcsönhatások megbízható és műszerfüggetlen vizsgálatához.


Szegletes Zsolt
Exoszomák és mikrovezikulák leképezése atomerő-mikroszkóppal

P24

Exoszomák és mikrovezikulák leképezése atomerő-mikroszkóppal

Szegletes Zsolt1, Harmati Mária2, Gyukity-Sebestyén Edina2, Dobra Gabriella2 és Buzás Krisztina2, 3

1 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

2 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biokémiai Intézet

3 Szegedi Tudományegyetem, Fogorvostudományi Kar

Az exoszómák és a mikrovezikulák különböző sejttípusok által kiválasztott néhányszor tíz nm-es membránvezikulák. Különböző molekulákat, így fehérjéket és nuklein savakat is tartalmazhatnak. Fontos szerepük van a tumorok fejlődésében, metasztaikus aktivitásában. Elektronmikroszkóppal és száraz mintán atomerő-mikroszkóppal nehéz a valós átmérőjüket meghatározni, ezért kifejlesztettünk egy olyan módszert, ahol csillám felszínhez kötve meg tudtuk határozni az exoszomák és a mikrovezikulák átmérőjét folyadékban.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük az UNKP Bolyai Plusz Kutatási Ösztöndíj, a “Bolyai János” Kutatási Ösztöndíj, a GINOP-2.3.2-15-2016-00015, 2017-2022 és a GINOP-2.3.2-15-2016-00001 pályázat biztosította támogatást.


Schay Gusztáv
Podocin egy lehetséges szerepe a glomeruláris résmembrán működésében

P23

Podocin egy lehetséges szerepe a glomeruláris résmembrán működésében 

Kétszeri Máté, Antal Violetta, Karancsiné Menyhárd Dóra, Schay Gusztáv, Tory Kálmán

Semmelweis Egyetem Biofizikai Intézet

A podocin egy membrán-lokalizált fehérje , a glomeruláris résmembrán alkotóeleme. Szteroid-rezisztens nephrosis szindrómában (SRNS) szenvedő betegek egy részében a podocint kódoló NPHS2 gén mutációját lehet kimutatni mint kóroki tényezőt. Korábban igazoltuk, hogy a podocin teljes mértékben a C-terminális helikális régióján keresztül létesített kötések segítségével képes oligomerizálódni. Eredményeink alapján a kóros oligomerizáció áll a hátterében variáns-társulások váratlan patogenitásának. Bizonyos patogén és nem patogén variánsok transz-asszociációja ugyanis patogén, mely autoszomális recesszív betegségekben szokatlan. A kóros oligomerizáció ezen esetekben a membrán-transzportot károsítja. Felmerül, hogy az oligomerizáció gátlása ezen esetekben terápiás lenne. Nem ismert azonban a podocin-oligomerizáció élettani jelentősége. Ismert, hogy a podocin a résmembrán kulcsfontosságú alkotóelemével, a nephrinhez kapcsolódik. Felmerül ezért, hogy a podocin oligomerizációja a nephrin oligomerizációját is befolyásolja. A podocin nephrin-oligomerizációra gyakorolt hatását tranziensen transzfektált HEK293 sejteken vizsgáltuk meg. Két, FRET-párt alkotó fluoreszcens festékkel jelölt nephrint és különböző podocin-variánsokat expresszáltunk, és a nephrin-nephrin távolságot mértük a podocin-variánsok függvényében. A podocin mutáció függvényében eltérő nephrin-oligomerizációt tudtunk kimutatni.

Köszönetnyilvánítás:

"A kutatás a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatásával készült (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017)”; MTA-SE Lendulet (LP2015-11/2015); NKFIA/OTKA K109718, K116305, KH125566, MedinProt Synergy

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Nizsalóczki Enikő
Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

P22

Az IL-9R és IL-2R térbeli kapcsolatának kvantitatív analízise humán T limfóma sejteken

Nizsalóczki Enikő1, Nagy Péter1, Mocsár Gábor1, Szabó Ágnes1, Csomós István1, Thomas A. Waldmann2, Vámosi György1, Mátyus László1, Bodnár Andrea1

1 DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Lymphoid Malignancies Branch, National Institutes of Health, Bethesda, USA

Az interleukin-9 (IL-9) egy multifunkcionális citokin, amelynek a T sejtek onkogenezisében betöltött szerepére egyre több adat utal. A heterodimer IL-9R komplexet a citokin-specifikus α-lánc és a közös γc alegység alkotja. Ez utóbbi alegység más citokinreceptorok, így a T sejt funkció szabályozásában központi szerepet betöltő IL-2R felépítésében is részt vesz. Konfokális mikroszkópiás képek Pearson-féle korrelációs analízisével korábban feltártuk az IL-9R és IL-2R kettős térbeli viszonyát humán T limfóma sejteken: míg a sejtek egy részében a két receptorfajta közös klaszterek kialakításában vesz részt, más sejtekre szegregált membrándoménekben történő elhelyezkedésük a jellemző. Jelen vizsgálatainkban tovább elemeztük a két receptorfajta térbeli kapcsolatát a Kit225/IL-9R humán T limfóma sejtvonalon. A konfokális mikroszkópiás képek elemzése során a Pearson-féle korrelációs együttható meghatározását kiegészítettük a Manders-féle co-occurance (együttes előfordulás) analízissel. Kimutattuk, hogy az IL-9 és IL-2 receptorok egy minimális, ám a véletlen által generálttól szignifikánsan magasabb hányadának ko-lokalizációja az összességében negatív korrelációt mutató (a két receptorfajtát döntően elkülönülő membránterületeken kifejező) sejteken is megfigyelhető. FRET kísérleteink igazolták az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek molekuláris szintű (1-10 nm) közelségét, azaz az alegységek közös klasztereinek jelenlétét. IL-9 kötődés hatására a FRET hatásfokok módosultak, ami az IL-9/IL-2R rendszer elemeinek konformáció változására és/vagy a receptor alegységek térbeli átrendeződésére utalhat. Hipotézisünk szerint az IL-9R és IL-2R általánosan előforduló klaszterei az IL-9/IL-9R jelátvitelhez szükséges „hot spot”-ként szolgálhatnak, amely elősegíti a közös receptor alegységek és jelátviteli molekulák optimális felhasználását és a megfelelő receptor komplexek összeszerelődését.

Madarász Tamás
Az IRSp53 fehérje membrán nanocsövek képződésében betöltött szerepe

P21

Az IRSp53 fehérje membrán nanocsövek képződésében betöltött szerepe

Madarász Tamás1,2, Brunner Brigitta4, Türmer Katalin1, Matkó János3, Nyitrai Miklós1,2 Szabó-Meleg Edina1,2

1 Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Biofizikai Intézet

2 Pécsi Tudományegyetem Szentágothai János Kutatóközpont

3 Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Immunológiai Tanszék

4 Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológiai Intézet

A sejtek közötti kapcsolat a felszínükön megjelenő membrán kitüremkedések, sejtnyúlványok (lamellipódiumok, filopódiumok, sejtfelszíni fodrozódások) közreműködésével valósul meg. Megfigyelések szerint ezek képződésének mechanizmusa nagyon hasonló. A membrán nanocsövek – mint filopódium-szerű sejt- sejt hidak – 2004-ben történt felfedezésével a sejtek közötti kommunikáció és anyagtranszport új formáját ismerhettük meg. Ezek a vékony membrán kitüremkedések fizikailag is összekötnek két sejtet. A membrán nanocsövek kialakulásának egyik feltételezett módja szerint azok aktin-függő membrán kitüremkedésekként, irányított, filopódium-szerű nyúlványokból fejlődnek ki. Ismert, hogy az inzulin receptor szubsztrát fehérje (IRSp53) elősegíti a filopódiumok kialakulását, ezért megvizsgáltuk annak membrán nanocsövek képződésének mechanizmusában betöltött szerepét.

Munkánk során különböző mikroszkópiai eljárásokkal (LSCM, SIM, TIRF) vizsgáltuk meg mind a teljes hosszúságú IRSp53 fehérje, mind a fehérje N-terminális részén található I-BAR domén filopódiumok, illetve nanocsövek kialakulására és morfológiájára gyakorolt hatását Cos7 sejtekben. Az alaktani vizsgálatok mellett az említett fehérjék aktin fehérjére gyakorolt hatását is feltérképeztük.

Az IRSp53 fehérje túlexpresszálása szembetűnő morfológiai változást okoz a sejteken: jelentős mértékben növeli a filopódiumok számát, illetve az aktin citoszkeletonra gyakorolt hatásának következtében figyelemre méltó eltéréseket eredményez mind a membrán nanocsövek hosszúságában, mind azok vastagságában.

Eredményeink arra engednek következtetni, hogy bár a membrán nanocsövek több tekintetben mutatnak hasonlóságot a filopódiumokkal, kialakulásuk alapvető mechanizmusaiban eltérnek azoktól.

Támogatás: GINOP-2.3.2-15-2016-00036, EFOP-3.6.1-16-2016-00004 projekt.

Fehér Ádám
A BK béta alegységek feltérképezése U-87 MG sejteken

P20

A BK béta alegységek feltérképezése U-87 MG sejteken

Fehér Ádám

Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A glioblasztóma az agy leggyakoribb primer rosszindulatú daganata, mely esetén az átlagos túlélési idő nem éri el a 15 hónapot. A glioblasztóma inváziójához bizonyítottan hozzájárul a feszültség- és Ca2+-függő BK ioncsatorna, ami a tumorsejtekben túlexpresszálódik és kórosan aktívvá válik a nyugvó gliasejtekhez képest. A BK csatorna sejtfelszíni expresszióját, illetve biofizikai paramétereit többek között a járulékos béta alegységek befolyásolják. Kísérleteinkkel célunk volt annak kiderítése, hogy a BK béta alegységek kifejeződése hogyan alakul a sejtciklus során, ami lehetővé tenné tumorsejteken a BK csatorna béta alegység mintázattól függő, specifikus gátlását. Kísérleteinkhez az U87-MG glioblasztóma sejtvonalat használtuk. Az M fázisba kolhicinnel, az S fázisba aphidicolinnal, a G0 fázisba pedig éheztetéssel sziknkronizáltuk a sejteket, melynek sikerességét áramlási citometriával igazoltuk. Ezután patch-clamp technikával, teljes sejtes konfigurációban mértük a glioblasztóma sejtek ionáramát beleértve a csúcsáramot és áramsűrűséget, valamint vizsgáltuk a béta alegységeken specifikusan ható farmakonok (arachidonsav, litokólsav) ionáram moduláló hatását, és ezeket összehasonlítottunk a különböző populációk közt.

Eredményeink alapján sikeres szinkronizációt követően a kolhicinnel kezelt M fázisú sejtek csúcsárama és felületegységre normált áramsűrűsége is szignifikánsan nagyobb volt a kontroll populációhoz képest, ellenben a G0 és S fázisú sejtek biofizikai adataival.

A farmakológiai mérések során mind a négy populáció hasonló eredményeket mutatott, miszerint az arachidonsav nem, de a litokólsav jelentősen megemelte a sejtek csúcsáramát. Ezek alapján nincs eltérés a béta alegység expresszióban a sejtciklus különböző fázisaiban, így az M fázisú sejteknél mért eltéréseket egy ismeretlen ionáram adja, mely azonosítását követően M fázis-specifikus farmakológiai célpont lehet.

Szabó Máté
Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

P2

Szterolok és többszörösen telítetlen zsírsavak dipólpotenciálra gyakorolt hatásának vizsgálata új áramlási citometriás módszerrel

Szabó Máté, Zákány Florina, Cs. Szabó Bence, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás1

1DE ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A dipólpotenciál (DP) +300 mV-os intramembrán potenciál, amely jelentősen befolyásolja a transzmembrán fehérjék konformációját és funkcióit. A membrán szterol tartalmának emelése növeli a DP nagyságát, így hiperkoleszterinémiában (HC), illetve Smith-Lemli-Opitz szindrómában (SLOS), ahol a membrán koleszterin, illetve 7-dehidrokoleszterin (7DHC) tartalma emelkedik, várható a DP patofiziológiai jelentőséggel bíró növekedése. A DP mérésére a legelterjedtebb módszer a di-8-ANEPPS fluorofórt alkalmazó spektrofluoriméteres vagy mikroszkópos excitációs aránymérés, melynek alkalmazhatósága azonban erőteljesen korlátozott, így célunk volt egy hatékony DP mérési módszer fejlesztése és tesztelése a fenti betegségek membránbiofizikai modelljeiben.

Munkánk során kidolgoztunk egy F66 feszültségszenzitív fluorofórt alkalmazó, emissziós aránymérésen (Rem) alapuló áramlási citométeres technikát a DP mérésére, összevetve eredményeinket spektrofluorimetriás referenciaméréseink adataival. Ismert DP-t módosító kezelések (phloretin, 6-ketocholestanol) használatával bizonyítottuk módszerünk alkalmazhatóságát, az F66 Rem negatív korrelációt mutatott a DP nagyságával (szenzitivitás: kb. -15%/100 mV). Ezután JY és THP-1 sejtvonalakon és humán PBMC-ken létrehoztuk a fenti betegségek modelljeit és meghatároztuk a DP nagyságát új módszerünkkel.

A HC, illetve SLOS modelljében kimutattuk, hogy a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalmának növelése a megfelelő metil-béta-ciklodextrin/szterol komplexekkel dózisfüggő módon növelte a DP nagyságát (∆Rem,max -14%, illetve -8%). A HC terápiájában kiegészítésként használt magas telítetlen zsírsav tartalmú diéta hatásának vizsgálata során omega-3 zsírsav alkalmazása dózisfüggően csökkentette, míg omega-6 zsírsav növelte a DP-t (∆Rem,max +10%, illetve -5%).

Új áramlási citometriás módszerünk alkalmazható nagyszámú élő sejt DP-jának gyors, egyszerű és megbízható mérésére és a sejtmembrán összetételének megváltozásával járó betegségek vizsgálatára.

Csóti Ágota
Rekombináns peptid toxinok előállítása Escherichia coli-ban

P19

Rekombináns peptid toxinok előállítása Escherichia coli-ban

Csóti Ágota1, Dorothy Wai2 Raymund S. Norton2 és Panyi György1

1 Debreceni Egyetem, ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Monash University (Australia), Monash Institute of Pharmaceutical Sciences

A „peptides to drugs” nemzetközi trenddel összhangban számos ioncsatorna gátló peptid terápiás hatását ismertük meg a közelmúltban, pl. az autoimmun betegségek esetén a nagy affinitású és szelektivitású Kv1.3 K+ csatorna gátló skorpió toxinokét. Egy toxin farmakológiai karakterizálásához, illetve a szerkezet-funkció összefüggés megismeréséhez nagy mennyiségű peptidre van szükség, de az állatokból nyerhető toxin mennyisége limitált. Célom olyan lejárás kidolgozása, ami lehetővé teszi a 3-4 diszulfid híddal rendelkező peptidek natív szerkezetben történő előállítását bakteriális expressziós rendszerben.

A peptid-toxinok rekombináns termelésével a peptidet nagy mennyiségben és költséghatékonyan lehet előállítani. Gondot jelet azonban a 3-4 diszulfid híd kialakítása, amihez speciális reduktív környezet kell. Az eljárást az Anuroctoxin (AnTx, 35 aminosavból álló peptid toxin) előállítására optimalizáltam, mely toxin részletes farmakológiai vizsgálatát laboratóriumunk végezte el. Kísérleteink során az anuroctoxint tioredoxin címkével ellátott fúziós fehérjeként állítottuk elő. A tioredoxin címke jelentősen hozzájárult a peptid „folding” mechanizmusához, biztosítva a folyamathoz szükséges reduktív környezetet. Ezt követően N15 jelölésre módosított eljárással NMR szerkezetvizsgálatra alkalmas peptidet kívánok előállítani. [1]

Végeredményben olyan toxin molekulát állítottunk elő, mely megfelel az elvárásoknak mind gazdasági és biológiai szempontok alapján, továbbá kiemelkedő biológiai azonossággal és kémiai tisztasággal jellemezhető, illetve képes helyettesíteni a vad típusú toxin molekulát.

Irodalom

[1] Chang, Shih Chieh, et al. "N-terminally extended analogues of ShK as potent and selective blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1. 3." The FEBS journal 282.12 (2015): 2247.

Batta Gyula
A Gaucher betegség in vitro modell sejtjeinek megnövekedett számú nanocső és extracelluláris vezikulum képzése

P18

A Gaucher betegség in vitro modell sejtjeinek megnövekedett számú nanocső és extracelluláris vezikulum képzése

Batta Gyula1,2; Malta Neri Lara Chrystina2; Visnovitz Tamás3; Visnovitzné Vukman Krisztina3; Buzás Edit3, Nagy Péter2

1Debreceni Egyetem, Természettudományi és Technológiai Kar, Genetikai és Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszék

2Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

3Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

Az örökletes Gaucher betegség egy olyan lizoszómális tárolási betegség, amelyben glikozilceramid és egyéb szfingolipidek felhalmozódnak a sejtekben, ami a glükocerebrozidáz enzim hibás működésének köszönhető. A betegség különböző megjelenési formákat mutat, melyek súlyossága tág határok között mozog. Bizonyos esetekben a diagnózis csak felnőtt korban történik meg, míg más típusai korai elhalálozáshoz vezetnek. A betegség során fellépő tüneteket klasszikusan elsősorban a megemésztetlen szubsztrátok lizoszómális felhalmozódásának tulajdonítják, ugyanakkor korábban sikerült bebizonyítanunk, hogy a plazmamembrán számos biofizikai és sejtbiológiai tulajdonsága is megváltozik, ami szintén hozzájárulhat a betegség tüneteinek kialakulásához.

A vizsgálatokhoz fluoreszcens mikroszkópot és „Tunable Resistive Pulse Sensing” (TRPS) mérésére alkalmas műszert alkalmaztunk. A Gaucher betegséget modellező makrofágok THP-1, illetve U937 monocita sejtvonalból származtak, melyekben a glükocerebrozidáz enzim működését CBE-vel (conduritol B epoxide) gátoltuk, és a differenciáltatást PMA-val (phorbol 12-myristate 13-acetate) indukáltuk.

A szfingolipidekben gazdag membránokban a raftszerűen rendezett membrándomének megnövekedése tapasztalható, ami a TNT-k („tunneling nanotube”) képzésének emelkedésével járt. Továbbá, méréseink alapján sikerült azt is kimutatni, hogy az extracelluláris vezikulumok (EV) képzése is megemelkedik a Gaucher modell makrofágok tenyésztése során. Ezeket az eredményeinket összevetve a korábbi eredményeinkkel, azt az előzetes következtetést vonhatjuk le, hogy a megnövekedett szfingolipid mennyiség a pozitív görbület kialakításának irányába tereli membránt (TNT és EV képzés), viszont ez magával vonzza az endocitózis csökkent hatékonyságát is.

Závodszky Péter
Ligand-induced conformational rearrangements regulate the switch between functions of ROCK2

P17

Ligand-induced conformational rearrangements regulate the switch between functions of ROCK2 

István Hajdú1, András Szilágyi1, Barbara Végh1, András Wacha2 Éva Gráczer1, Dániel Györffy1, Márk Somogyi1, Péter Závodszky1

1Institute of Enzymology, RCNS, HAS, Budapest,

2Institute of Materials and Environmental Chemistry. RCNS, HAS, Budapest

Rho-associated protein kinase 2 (ROCK2) is a membrane-anchored, long, flexible, multidomain, multifunctional protein. Its functions can be placed into two categories: membrane-proximal and membrane-distal ones. A recent study concluded that membrane–distal functions, e.g. regulatory myosin light chain (RMLC) phosphorylation requires a fully extended conformation, and this conclusion was supported by electron microscopy. The present solution small angle X-ray scattering (SAXS) study revealed that ROCK2 population is a dynamic mixture of folded and partially extended conformers. We have shown that the predicted, auto-inhibited, folded conformation of ROCK2 exists in solution, and is stabilized by weak non-covalent interactions between the N- and C-termini. Binding of RhoA to the coiled-coil domain shifts the equilibrium towards the partially extended state. The binding of natural protein substrates (e.g. LIMK1) to the kinase domain breaks up the interaction between the N-terminal kinase and C-terminal regulatory domains, but smaller substrate analogues do not. The present studies reflect the dynamic behaviour of this long, dimeric molecule in solution, and our structural model provides a mechanistic explanation for a set of membrane-proximal functions, while allowing for the existence of an extended conformation in the case of membrane-distal functions.

Ujfalusi Zoltán
Röntgen/CT kontrasztanyagok hatása az aktin polimerizációs dinamikájára

P15

Röntgen/CT kontrasztanyagok hatása az aktin polimerizációs dinamikájára 

Gárdos András Gergő, Hild Gábor, Ujfalusi Zoltán

PTE ÁOK Biofizikai Intézet, 7624 Pécs, Szigeti út 12.

Bizonyos szövetekről készített felvételek a legtöbb képalkotási eljárás esetében valamilyen mértékben kontrasztszegények. Már az 1800-as évek végén felmerült az igény különböző kontrasztanyagok használatára. Sok toxikus anyag nem humán alkalmazása után az áttörés 1923-ban jött el, mikor egy véletlennek köszönhetően felfedezték a jódtartalmú vegyületek nagyon jó röntgen-elnyelő képességét és humán diagnosztikában várható lehetséges előnyeit. Innentől már felgyorsultak az események és a cél az egyre nagyobb biztonsággal adható, kevesebb mellékhatással rendelkező kontrasztágensek kifejlesztése lett, így az ionos, nagy ozmolalitású vegyületeket nem ionos, a jódot kovalensen kötő, alacsonyabb ozmolalitású kontrasztanyagok váltották fel. Napjainkban egy radiológus szakorvos igen sokféle kontrasztanyag közül választhat, mind röntgen/CT, mind MRI vizsgálatokhoz.

A vonatkozó irodalom áttekintéséből kitűnik, hogy a klinikumban jelenleg rutinszerűen alkalmazott kontrasztanyagok aktin citoszkeletonra közvetlenül gyakorolt molekuláris hatásmechanizmusa egyáltalán nem ismert. Így célul tűztük ki a kontrasztanyagok szöveti sejtekre, bennük az aktin sejtvázra és annak kötőfehérjéivel való kapcsolatára kifejtett hatásainak vizsgálatát. A fehérje preparálási protokollt, alkalmazandó koncentrációkat és pufferkörnyezetet sikeresen optimalizáltuk. Eddigi kutatásaink során két jód-tartalmú (Iomeron 300, ill. Xenetix 350) kontrasztanyaggal végeztünk kísérleteket. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy az általunk vizsgált kontrasztanyagok közvetlenül befolyásolják az aktin fehérje működését, polimerizációs dinamikáját.

Telek Elek
A rendezetlen miozin 16 C-terminális szerkezeti karakterizálása

P15

A rendezetlen miozin 16 C-terminális szerkezeti karakterizálása 

Telek Elek1,4, Kengyel András1,2,4, Karádi Kristóf1,2, Kardos József3, Bugyi Beáta1,2, Nyitrai Miklós1,2,4 és Lukács András1,2,4

1 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai Intézet

2Szentágothai János Kutató Központ

3Eötvös Lóránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék

4MTA-PTE Nukleáris-Mitokondriális Interakciók Kutató Csoport

A miozin 16 (Myo16) egy nem-konvencionális motorfehérje, mely főként emlős idegsejtekben expresszálódik. Korábbi kísérletekben kimutatták szerepét neurodegeneratív kórképekben, úgymint a Myo16 expresszió szint növekedése skizofréniában [1], Myo16 gén deléció autizmusban [2], valamint szerepet játszhat a bipoláris szindrómában [3].

A Myo16 monomer motorfehérje négy szerkezeti alegységből épül fel: tartalmaz egy ankyrin ismétlődéseket tartalmazó N-terminális domént, egy motor domént, egy könnyű lánc kötő IQ motívumot, és egy, a miozinok között egyedülálló, rendezetlen szerkezetű C-terminális domént (Myo16Tail), mely feltételezett szerepet játszik a neuronális foszfoinozitid-3 kináz jelátvitelben [4].

Célunk a rendezetlen Myo16Tail szerkezetének karakterizálása bioinformatikai és spektroszkópiai módszerekkel.

Kísérleteinkben az IQ motívumot is tartalmazó Myo16Tail szekvenciát vizsgáltuk bioinformatikai módszerekkel, úgymint fehérje rendezetlenségi predikciók (VLXT, VL3-BA, VSL2b, Ronn és IUPRED), szerkezeti flexibilitás (DynaMine), valamint foszforilációs hely predikció (PhosphositePlus).

Továbbá triptofán fluoreszcencia (steady-state és időfelbontásos anizotrópia, valamint fluoreszcencia kioltás) és CD spektroszkópiai módszereket alkalmaztunk a Myo16Tail szerkezetének jellemzéséhez.

Eredményeink szerint a Myo16Tail nagymértékben tartalmaz rendezetlen fehérje régiókat (44%), a másodlagos szerkezeti elemek mellett. A rendezetlenség jelenléte hozzájárulhat a Myo16 biológiai funkciójának megértéséhez.

Köszönetnyilvánítás
OTKA K 112794, Molecular Mechanisms Underlying the Function of Myosin 16b, OTKA K 120391, KH 125597, Szerkezetvizsgáló módszer fejlesztése a rendezetlen fehérjék szerkezetének és kölcsönhatásainak vizsgálatára (K. J.)

Irodalom

[1] Rodriguez-Murillo L, et al. (2014) Neuropsychopharmacology 39(4):934-43

[2] Liu YF, et al. (2015) PLoS One. 10(4):1-18

[3] Kao, C. et al. (2016) Int. J. Neuropsychopharmacol. 19: 1-11

[4] Yokoyama et al. (2011) EMBO J. 30(23):4739-54

Somkuti Judit
G-quadruplexek vizsgálata infravörös spektroszkópiával

P14

G-quadruplexek vizsgálata infravörös spektroszkópiával 

Somkuti Judit és Smeller László

Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A DNS molekula a kettős hélix szerkezet mellett számos más egzotikus struktúrát vehet fel. Ezek egyike a G-quadruplex szerkezet, amelyben guanin bázisok szerveződnek planáris struktúrába. Négy guanin bázis kapcsolódik Hoogsteen féle kölcsönhatásokkal egymáshoz és ezekből a síkbeli négyesekből tipikusan kettő vagy három van egymás fölött.

A quadruplexek jelentőségét növelte, amikor felfedezték, hogy a DNS lánc végén elhelyezkedő telomér régió szekvenciája olyan, hogy benne a G-quadruplex szerkezetek könnyen megjelenhetnek. Ugyancsak találtak quadruplex struktúrákat egyes onkogének és protoonkogének promóter szekvenciáiban. A G-quadruplex térszerkezet gátolhatja ezek kifejeződését, illetve a telomér régióban gátolja a telomeráz aktivitást.

Kísérleteinkben a trombin kötő aptamert (TBA) és a humán telomér régióban előforduló szekvenciát (Htel) használtuk. A szerkezeti változásokat Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiával (FTIR) követtük egy gyémánt cellában, különböző nyomás, hőmérséklet és zsúfoltsági körülmények között.

A G-quadruplexek kitekeredése több infravörös rezgést is befolyásol, amiket követni tudtunk. Ezek közül a legjellegzetesebb az 1537 cm-1-nél található sáv, ami a guanin bázisok közötti Hoogsteen féle hidrogénkötésre jellemző [1].

A Htel szerkezete sokkal nagyobb hőstabilitást mutatott, ami azzal magyarázható, hogy a humán telomér háromszintű G-quadruplexet alkot, a TBA-ban pedig csak két egymással párhuzamos G-tetrád jelenik meg.

Nagyobb nyomáson mindkét aptamer hőstabilitása növekedett. Htel esetén 10 kbar-on az átalakulási hőmérséklet több mint 10 °C-ot emelkedett. A nyomás és hőstabilitást különböző koncentrációknál vizsgáltuk. A nagyobb koncentráció növelte a stabilitást a molekuláris zsúfoltság hatásai miatt.

Köszönetnyilvánítás

K-124697 NKFI pályázat

Irodalom

[1] Mondragón-Sánchez JA, Liquier J, Shafer RH, Taillandier E (2004) Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 22:365-373

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Smeller László
G-quadruplex szerkezetek stabilitása és kölcsönhatásai

P13

G-quadruplex szerkezetek stabilitása és kölcsönhatásai 

Smeller László, Adányi Mónika, Pfalzgraf Frederik, Végh András, Gál Róbert és Somkuti Judit

Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A guaninban gazdag DNS szekvenciák a hagyományos dupla szálú elrendeződés mellett más, egzotikus struktúrába is szerveződhetnek. Ezek a négyszálú tetraplex (másnéven quadruplex) szerkezetek különleges figyelmet kaptak, amikor kiderült, hogy jelen vannak a DNS telomér régióiban, ill. egyes onkogének promóter régióiban. Ez a struktúra úgy alakul ki, hogy egy síkban négy guanin bázis kapcsolódik össze, ún. Hoogsten féle kölcsönhatásokkal. Egy G-quadruplexet (GQ) tipikusan kettő vagy három ilyen sík alkothat.

A GQ szerkezetek fent említett régiókban való jelenléte fontos gyógyszer-célponttá tette őket. A telomér GQ-k stabilizálása a rákkutatás egyik iránya. Kísérleteinkben a GQ-k stabilitását mértük különböző környezeti paraméterek mellett, ill. GQ-hoz kötődő molekulák hatására. A nyomásstabilitás ill. a hőstabilitás nyomásfüggése egy eddig elhanyagolt terület volt, pedig ezekből a mérésekből jelentős térfogati információk kaphatóak.

Méréseinkben főleg kétféle aptamert használtunk, a 15 bázisból álló trombin-kötő aptamert (TBA), és a humán telomér régió tipikus szekvenciáját (Htel). A fluoreszcens mérésekhez a DNS szakaszok végeihez fluoreszcens jelölőket kapcsoltunk, amelyek FRET párt alkottak. Az infravörös (FTIR) mérésekhez jelöletlen mintát használtunk.

Meghatároztuk a TBA és a Htel p-T fázisdiagramját, széles koncentráció-tartományban. Ezt az infravörös és fluoreszcens mérések kombinálása tette lehetővé. Míg a spektroszkópiai mérések nagy része híg oldatokban történik, a sejt belsejében a makromolekulák koncentrációja a 30-40%-ot is eléri. A koncentrációfüggés tehát nem l’art pour l’art jelenség, hanem rávilágít arra, hogy a makromolekuláris zsúfoltság jelentősen befolyásolhatja a makromolekulák térszerkezetének stabilitását. Ez már fehérjék esetén bebizonyosodott [1], és jelen méréseink szerint ez nincs másképp a nukleinsavak esetén sem.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NKFI K-124697 pályázat támogatta.

Irodalom

[1] Somkuti és mtsai (2017) Biophys Chem. 231:125-134

Mártonfalvi Zsolt
Kálcium hatása a titin rugalmasságára

P12

Kálcium hatása a titin rugalmasságára 

Mártonfalvi Zsolt1, Bánkuti Stefánia1, Guy Ben-Arie1 és Kellermayer Miklós1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

A titin a harántcsíkolt izom rugalmasságát meghatározó szarkomerikus óriásfehérje, mely egyetlen polipeptidláncként a teljes félszarkomert áthidalja a Z-lemeztől az M- csíkig. Habár elsősorban a megnyújtott szarkomerekben ébredő passzív izomerő kialakításában játszik fontos szerepet, feltételezhető, hogy a kontraktilis apparátus aktivációja dinamikusan változtatja a titinnanomechanikai tulajdonságait. Korábbi kísérletek rámutattak, hogy a titin PEVK doménjének glutaminsavban gazdag polyE szekvencia motívumai nagy affinitással kötik a kálciumot. Feltételezhető, hogy a kálcium ionok a PEVK domén glutaminsav oldalláncait keresztkötik, ezzel lerövidítik és mechanikai értelemben passziválják, vagyis nyújthatatlanná teszik a domén egyes motívumait. Annak vizsgálatára, hogy ezen kálcium kötő szekvenciák milyen módon befolyásolják a titin rugalmasságát, egyedi titinmolekulákon végeztünk nyújtási kísérleteket lamináris áramlási folyadékcellában lézercsipesszel. A kísérleti elrendezésben a csapdázott molekulát körülvevő puffer kálcium koncentrációja gyorsan változtatható volt, miközben ismétlődő ciklusokban nyújtás-visszaengedési kísérleteket végeztünk. Mikor a molekulákat magas koncentrációjú (pCa 3) pufferben nyújtottuk, a titin látszólagos perzisztenciahossza csökkent. Ennek következményeként a titinmolekulák egy kompaktabb szerkezetet vettek fel, ami a csapdázott polipeptidlánc rövidülését okozta. Eredményeink arra utalnak, hogy a titin egy kálcium érzékeny rugalmas fehérje, következésképp a szarkomerben ébredő passzív erőkifejtés kálcium jelenlétében nagyobb, mint relaxált állapotban.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük az NKFI Fiatal kutatói témapályázat, MTA Bolyai János Kutatói Ösztöndíj és az EMMI Új Nemzeti Kiválóság Program támogatást.

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Longauer Beáta
A22 alter the polymerization properties of the bacterial actin-like MreB

P11

A22 alter the polymerization properties of the bacterial actin-like MreB 

Beáta Longauer1, Szilvia Barkó1,2, Dávid Szatmári1, Zoltán Ujfalusi1,

and Miklós Nyitrai1,2,3

1Department of Biophysics, Medical School, University of Pécs

2Szentágothai Research Centre, University of Pécs, Hungary

3MTA-PTE Nuclear-Mitochondrial Interactions Research Group, Pécs, Hungary

The MreB protein is an actin orthologue in bacteria and similarly to actin it has essential role in the maintenance of cell shape. It is a crucial component of the cell growth, division and cell wall synthesis. Another common property of MreB and actin is the ability of binding and hydrolysing ATP[1]. A22 (S-(3,4-dichlorbenzyl)isothiourea) is the first chemical compound which was found to inhibits directly the MreB function in vivo. The mechanism of inhibition is not clear yet. Because this drug does not have any cytotoxic and genotoxic effects on eukaryotic cell lines, it could be a novel antibiotic agent against multidrug-resistant bacteria [2].

We studied the polymerization properties of Leptospira interrogans MreB (Li-MreB) protein in the presence of A22. Our spectroscopic data showed that A22 has significant effect on the ATP hydrolysis of MreB. By the help of fluorescent microscopy measurements we observed that the macroscopic conformation of the evolved filaments differs significantly in the presence and absence of A22. In case of GFP expressing E. coli cells, the A22 causes round cell shape (as it was described before) but MreB filaments did not dissociated to monomeric level.

We assume that in normal physiological circumstances the MreB molecules bind ATP or ADP-Pi, build long, stable filaments. In the presence of A22 the shortening of MreB filaments can be observed and although the relative amount of MreB filaments does not change, this conformation is not able to maintain the normal cell shape. Consequently, this MreB sensitive drug could be a good candidate in the war against antibiotic resistant bacteria.

Acknowledgment:

OTKA-107776: An anchor biological systems characteristics: the structural and functional properties of bacterial filaments.

References:

[1] Esue, O. et al. (2005). J. Biol. Chem. 280: 2628–35.

[2] Bonez, P. C. et al. (2016). Microbial Pathogenesis, 99, 14–18.

Liliom Károly
Kalmodulin konformereinek azonosítása tirozin aminosavainak fluoreszcencia életidő mérésével

P10

Kalmodulin konformereinek azonosítása tirozin aminosavainak fluoreszcencia életidő mérésével

Liliom Károly1, Schay Gusztáv1, Arian Jafari1 és Juhász Tünde2

1 Semmelweis Egyetem, ÁOK Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

2 MTA Természettudományi Kutatóközpont, Anyag és Környezetkémiai Intézet

A kalmodulin (CaM) – az eukarióta sejtek intracelluláris Ca2+-szenzor fehérjéje – 148 aminosavból épül fel, amelyek két doménbe rendeződnek. Az N- és C-terminális domének mindegyike két-két Ca2+-szelektív kötőhelyet tartalmaz („EF-kéz” motívumok). A kalcium-ionok kötődésének hatására a CaM konformációja megváltozik, a két domént összekötő hélix-hurok-hélix szerkezet iniciációs pontjainál hidrofób felszínek nyílnak meg, együttesen lehetővé téve a CaM célfehérjékhez kötődését. Nem-aktivált sejtekben az intracelluláris Ca2+-koncentráció ~100 nM, amely aktivált sejtekben ~10 mM, esetenként ennél is magasabb értéket vehet fel. Rendkívül változatos azonban a Ca2+-jelek időbeli és térbeli mintázata a tranziens lefutású jelektől (~0,1-100 s) a Ca2+-hullámokig (~0,1–10 Hz). A CaM közvetítésével több száz effektor-fehérje is aktiválódhat, azonban adott sejtben az aktivációt kiváltó mechanizmustól függően tipikus jelátviteli útvonalak kapcsolnak be néhány, talán tucatnyi CaM effektort érintve. Felmerül a kérdés, hogy milyen mechanizmusok biztosítják az aktiváció-specifikus CaM-effektorfehérje komplexek kialakulását?

Hipotézisünk szerint ebben szerepe lehet a CaM Ca2+-jelalak-függő konformációs szelekciójának. Módszert dolgoztunk ki a CaM konformációs állapotainak detektálására a CaM két tirozin aminosava saját fluoreszcenciájának követésével. A konformációra legérzékenyebb a fluoreszcencia életidő mérése, amely adatokra multiexponenciális függvényt illesztve azonosíthatjuk a különböző konformereket. Módszerünkkel négy komponenst tudtunk azonosítani, amelyek életideje és a teljes fluoreszcencia-intenzitásbeli részarányuk érzékenyen változik a Ca2+-koncentrációval, amit a 0 – 10 M tartományban változtattunk 5 M állandó CaM koncentráció (20 M Ca2+-kötőhely) mellett, elkerülve a CaM teljes Ca2+-telítését.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatásával készült (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017)

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.


Csomós István
Kelidonin hatása a STAT3 transzkripciós faktor tirozin és szerin foszforilációjára humán uveális melanóma sejteken

P1

Kelidonin hatása a STAT3 transzkripciós faktor tirozin és szerin foszforilációjára humán uveális melanóma sejteken

Csomós István, Szoták Evelin, Filep Csenge, Nizsalóczki Enikő, Mátyus László, Bodnár Andrea

Debreceni Egyetem ÁOK, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A STAT3 transzkripciós faktor számos, a sejtciklus szabályozásában, a sejtproliferációban, túlélésben és migrációban kritikus gén átíródását váltja ki, így a tumorellenes terápiák ígéretes célpontja. Egyik fontos aktivátora az IL-6, melynek emelkedett szintjét több daganatos kórképben, így uveális melanómában is leírták. A STAT3 aktiválódását tirozin (Y705) oldalláncon történő foszforilációja váltja ki, melyet dimerizáció és magi transzlokáció követ. A STAT3 szerin (S727) oldalláncon is foszforilálódhat, akár stimuláció hiányában is. Ennek pontos funkciója még nem ismert, de feltételezik szerepét a STAT3 működés finomhangolásában.

Kísérleteinkben a benzofenantridin alkaloidok közé tartozó kelidonin hatását vizsgáltuk az IL-6R/STAT3 jelátviteli útvonalra humán uveális melanóma sejteken. Korábban több tumoreredetű sejt esetén kimutatták a kelidonin proliferáció gátló és sejthalál indukáló hatását, emellett gátolja a mikrotubulus polimerizációt, befolyásolja a sejtciklust.

A vizsgált fehérjék expressziós szintjét és lokalizációját immunfluoreszcenciás jelzést követően áramlási citometriával, illetve konfokális mikroszkópiával vizsgáltuk.

Kelidonin hatására a sejtek egy jelentős részében megnőtt az alap pS-STAT3 szint, amelyet az IL-6 stimuláció már nem emelt tovább. A megemelkedett pS-STAT3 szintet a tirozin foszforiláció és magi transzlokáció gátlása kísérte. A kétfajta foszforilációra gyakorolt hatás közötti korreláció időfüggést mutatott: a pY-STAT3 szint csökkenése időben késleltetett volt a pS-STAT3 szint emelkedéséhez képest. Az IL-6Rα és a STAT3 expresszió nem változott, ugyanakkor megjelent egy csökkent gp130 expresszióval rendelkező sejtpopuláció. Adataink alátámasztják az IL-6R/STAT3 útvonal szerepét a kelidonin hatásmechanizmusában. A kelidonin STAT3 aktiválhatóságra gyakorolt hatásához a gp130 expresszió csökkenése, illetve a bazális szerin foszforilációs szint megemelkedése egyaránt hozzájárulhat.

Huber Tamás
A Flightless-I (Fli-I) szerepe az aktin citoszkeleton szerveződésében

P8

A Flightless-I (Fli-I) szerepe az aktin citoszkeleton szerveződésében

Gaszler Péter1, Vig Andrea Teréz1, Pintér Réka1, Huber Tamás1, Bugyi Beáta1

1 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai Intézet

A Flightless-I (Fli-I) egy viszonylag újonnan felfedezett fehérje, melynek szekvenciája leucinban gazdag ismétlődéseket és gelsolin homológia doméneket (GH1-6) ötvöz. A Fli-I szöveti előfordulása igen széleskörű, legnagyobb mértékben váz-, szívizom és idegsejtekben található meg. A Fli-I a sejtmagban egy hormonálisan szabályozott magi receptor koaktivátoraként működik. Szérum jelenlétében a Fli-I áthelyeződik a magból a citoplazmába, ahol a sejtmigráció negatív regulátora, mely révén gátolhatja a sebgyógyulást és a szöveti regenerációt. Mivel a Fli-I és aktin közötti citoplazmatikus folyamatok nem teljesen ismertek, célul tűztük különböző, rekombináns technikával előállított Fli-I konstruktok és az aktin közötti kölcsönhatások in vitro vizsgálatát fluoreszcencia spektroszkópiai és TIRF mikroszkópos módszerekkel.

Eredményeink alapján a Fli-I kölcsönhat az aktin monomerekkel és filamentumokkal is, melynek révén multifunkcionális aktivitásokkal bír (de novo nucleáció és sapkázás). A gelsolintól eltérő módon, a Fli-I és aktin közötti kölcsönhatások kalcium függetlenek, ami a konzervált II-es típusú kalciumkötő helyek hiányával magyarázható. A kis aktinkötő fehérje, a profilin a Fli-I aktin aktivitásainak finomhangolója; míg a de novo nukleációt gátolja, addig a Fli-I filamentumvég sapkázó aktivitását nem befolyásolja.

Eredményeinket összefoglalva, citoplazmatikus környezetben az aktin filamentum végeken a Flightless-I a monomerek beépülésének gátlásával befolyásolja az aktin citoszkeleton dinamikáját. Így, a sejtmigrációra gyakorolt negatív hatása megmagyarázhatja szerepét a sebgyógyulás és a szöveti regeneráció folyamataiban.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás Az Emberi Erőforrások Minisztériuma ÚNKP-18-2-1 kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának támogatásával készült (GP). Köszönjük Mihály Józsefnek (MTA, Szegedi Biológiai Kutatóközpont), hogy rendelkezésünkre bocsátotta a D. melanogaster Flightless-I plazmid konstrukciókat.


Kretzer Balázs
DNS-porfirin kötődés folyamatának vizsgálata egyedi molekula erőspektroszkópiás módszerekkel

P9

DNS-porfirin kötődés folyamatának vizsgálata egyedi molekula erőspektroszkópiás módszerekkel

Kretzer Balázs1, Kellermayer Miklós1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet, Budapest

A porfirineket és azok származékait régóta nagy tudományos érdeklődés övezi a fotodinamikus terápiában (PDT) betöltött szerepük miatt. Megfelelő hullámhosszúságú fénnyel gerjesztve e molekulákat reaktív oxigéngyökök és egyéb szabadgyökök keletkeznek. Továbbá a kationos származékok – például a tetrakis(4-N-metil)piridil-porfin – DNS-hez való kötődése potenciálisan gátolhatja a replikációs folyamatot.

A DNS-porfirin kölcsönhatások részletesebb leírására fontos lenne meghatározni a DNS nanomechanikai változásait, amiket a porfirin bekötődése okoz.

A porfirinmentes és a porfirinkötött DNS-komplexek nanomechanikai tulajdonságainak mérésére konfokális mikroszkópiával kiegészített optikai csipeszt használtunk. Továbbá kialakítottunk egy módszert a DNS-ben bekövetkező változások vizsgálatára.

Kimutattuk a porfirin molekulák okozta megnyúlást kettős szálú DNS esetében. Ezenkívül koncentráció-gradiens mentén vizsgáltuk a kötődést jellemző reakciósebességeket. A mért reakciósebességek olyan nagynak bizonyultak – a vizsgált porfirinmolekula kis mérete és nagy fajlagos töltése miatt –, hogy a koncentráció-gradiens sebességkorlátozó tényezőnek minősült.

A hosszú távú célunk a DNS-porfirin komplexben bekövetkező nanomechanikai változások koncentrációfüggésének vizsgálata. A mérések kivitelezésére optikai csipesz az optimális eszköz, továbbá az így kapott eredményeket atomi erő mikroszkópiás (AFM) kísérletekkel lehet alátámasztani. Ezen túlmenően olyan módszer kidolgozására törekszünk, amellyel mérhetővé válik a kötődés kinetikája. Ezáltal képesek leszünk a DNS kis molekulákkal történő kölcsönhatásainak molekuláris mechanizmusát feltérképezni egyedi molekula erőspektroszkópiás módszerekkel.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatásával készült (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017)

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Bioszenzorika és bio-nanotechnológia

Aug 28 - szerda

8:30 – 10:00

Elnök: Vonderviszt Ferenc, Kellermayer Miklós

08:30 – 08:55

Kelemen Lóránd
Label-free protein detection with an optofluidic lab-on-chip sensor

E23

Label-free protein detection with an optofluidic lab-on-chip sensor

Lóránd Kelemen1,*, Eugenia Lepera2, Bence Horváth1, Pál Ormos1, Roberto Osellame2 and Rebeca Martínez Vázquez2

1 Biological Research Centre, Institute of Biophysics, Hungarian Academy of Sciences, Temesvári krt. 62, 6726 Szeged, Hungary;

2 Institute for Photonics and Nanotechnologies, National Research Council, Piazza Leonardo da Vinci, 32, 20133 Milan, Italy

Whispering gallery mode (WGM) resonators are promising optical structures for microfluidic label-free biosensors mainly due to their high sensitivity. Their real laboratory diagnostic application however lacks a robust fabrication method that offers a complete device of practical value. Here we report on a monolithic lab on a chip sensor fabricated by a hybrid femtosecond laser micromachining approach, for label-free biosensing of a selected protein. It consists of a polymer WGM microresonator sensor made by two-photon polymerization directly inside a glass microfludic chip prepared by laser-assisted etching. The device, after a thorough geometry optimization, presents a refractive index change sensitivity of 61 nm/RIU. We demonstrate its bio-sensing capability exploiting the biotin-streptavidin binding affinity, obtaining a detectable minimum protein surface density increase of 67 x 103 molecules/µm2.

Acknowledgements

This work was supported by funding received from the CONCERT-Japan Photonic Manufacturing Joint Call (FEASIBLE project), GINOP-2.3.2-15- 2016-00001, GINOP-2.3.3-15-2016-00040 and the European Union's Horizon 2020 Research and Innovation Programme under grant agreement No. 654148 Laserlab-Europe.

08:55 – 09:15

Kertész Krisztián
Színek módosítása lepkék szárnyán

E24

Színek módosítása lepkék szárnyán

Kertész Krisztián1, Piszter Gábor1, Horváth Zsolt Endre1 Bálint Zsolt2, és Biró László Péter1

1 Energiatudományi Kutatóközpont, Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézet

2 Magyar Természettudományi Múzeum, Lepkegyűjtemény

A természetben több példa fellelhető nanoszerkezetből származó színek képződésére, különösen látványos ez az ízeltlábúak között. A lepkeszárnyak esetében az irizáló kék szín a szárnypikkelyben található, fény hullámhosszával összemérhető méretű nanoarchitektúra és a festékanyagok összességének eredménye [1].

Korábban megmutattuk az Európából és Ázsiából származó (> 300 egyed) hím Ikarusz boglárka példányok vizsgálatával, hogy a faj egyedei színbeli eltérést mutatnak a kontinensek között [2]. Ugyanakkor igazoltuk [3], hogy hosszú idejű hűtés hatására a báb állapot ideje akár megtízszerezhető, de ennek hatására a szerkezeti eredetű színek alig változnak, míg a pigment eredetű mintázat drasztikus változást szenved. Most a kísérletek megismétlésével vizsgáljuk a reprodukálhatóságot, és pontosítjuk az elért változások jellemzését. A szerkezeti színek stabilitása fontos tulajdonság a vizsgált alkalmazási lehetőségek szempontjából.

A szerkezeti eredetű színek esetében megváltozik a szárnyakról visszavert fény jellemző spektruma, ha a környezeti levegőbe más, eltérő törésmutatójú anyagot keverünk. A spektrométerrel mérhető változás összefügg a hozzáadott anyag koncentrációjával és anyagi minőségével [4], és az összefüggést hangolni is lehet [5]. Jelen munkában megmutatjuk hasonló nanoszerkezetek eltérő érzékelési tulajdonságait [6] valamint levegőhöz adott kétkomponensű gőzkeverékek érzékelésének lehetőségét.

Köszönetnyilvánítás

Munkánkat támogatja az OTKA K111741 és K115724.

Irodalom

[1] Biró LP, Vigneron JP (2011) Laser Photon Rev 5: 27.

[2] Kertész K, Piszter G, Bálint Zs, Biró LP (2019) Sci Rep 9: 2338.

[3] Kertész K, Piszter G, Horváth ZsE, Bálint Zs, Biró LP (2017) Sci Rep 7: 1118.

[4] Potyrailo RA, Ghiradella H, Vertiatchikh A, Dovidenko K, Cournoyer J, Olson E (2007) Nat Photonics 1: 123-128.

[5] Piszter G, Kertész K, Bálint Zs, Biró LP (2016) Sensors 16: 1446.

[6] Kertész K, Piszter G, Bálint Zs, Biró LP (2018) Sensors 18: 4282.

09:15 – 09:30

Kiss Bálint
Virális DNS kilökődés bakteriális membrán modellekben

E25

Virális DNS kilökődés bakteriális membrán modellekben

Kiss Bálint1 , Tordai Hedvig1 , Bozó Tamás1 , Kellermayer Miklós1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet, Budapest

Gram-negatív baktériumok sejtfalának külső felszínét nagyrészt fehérjék és lipopoliszacharidok (LPS) alkotják. Ezen alkotóelemek között található az a molekula melyet a T7 bakteriofágok fertőzésük kezdetén felismernek. Az, hogy a letapadást követően milyen szerkezetbeli változások indítják be és valósítják meg a virális genom bejuttatását a célsejtbe részleteiben feltáratlan. Célunk egy olyan modellmembrán felépítése melynek segítségével a T7 fágok kikötődése és ezt követően a DNS kilökődése megfigyelhető. Ahhoz, hogy az LPS által alkotott szupramolekuláris struktúrákat, illetve az LPS bakteriális membrán szerkezetére való hatását jobban megérthessük, lipid kettősrétegekhez hozzáadott LPS mintákat készítettünk, illetve különféle összetételű és LPS tartalmú liposzómákat preparáltunk extrúziós módszerrel. A vizsgálatokat atomerőmikroszkópos (AFM) képalkotás segítségével végeztük. Az atomerőmikroszkópos felvételeken azonosítottuk az LPS-eket, megfigyeltük a membránon belüli eloszlásukat és a lipid kettősrétegekre gyakorolt hatásukat. Megvizsgáltuk, hogy milyen hatással van magára a lipid kettősrétegre, illetve a membránban szétoszló LPS molekulákra a hőmérséklet változtatása és az oldószer összetétele. Ahhoz, hogy a natív állapothoz a lehető legközelebbi modellt alkothassunk E. coli külső membrán kivonatot készítettünk. A virális DNS kilökődést LPS tartalmú minták jelenlétében vizsgáltuk fluoreszcens, illetve lézercsipeszes technikákkal. Mivel a bakteriofágok vélhetően az LPS-t, vagy az LPS rétegbe ágyazódó fehérjéket ismerik fel a fertőzési ciklus kezdő lépéseként, munkánk hosszútávú célja az LPS tartalmú membránok pontosabb megértésén keresztül egy olyan optimálizált modellrendszer létrehozása, amelyben a T7 bakteriofág fertőzési mechanizmusa viszonylag könnyen tanulmányozhatóvá válik.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás a Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatásával készült (Nemzeti Szívprogram NVKP-16-1-2016-0017, OTKA K124966)

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

09:30 – 09:45

Gerecsei Tamás
Felületi kölcsönhatások erősségének egyedi-sejt szintű mérése automatizált mikropipettával

E26

Felületi kölcsönhatások erősségének egyedi-sejt szintű mérése automatizált mikropipettával

Gerecsei Tamás1,2, Erdődi István3, Székács Inna2, Hős Csaba3, Szabó Bálint1,2 és Horváth Róbert2

1 ELTE TTK, Biológiai Fizika Tanszék

2 MTA EK MFA Nanobioszenzorika Kutatócsoport

3 BME GPK Hidrodinamikai Rendszerek Tanszék

A biológiai tudományokban zajló robbanásszerű fejlődés jelentős felismerései közé tartozik, hogy az élő sejtek populáció jóval kevésbé homogének mint azt korábban feltételezték, ezért az úgynevezett egyedi-sejtes technológiák mára meghatározó kutatási iránnyá váltak a kísérletes biológia és a biofizika területén. Egy alapvető biológiai jelenség, az adhézió, egyedi-sejt szintű mérésére jelenleg még kevés módszer létezik, azonban a terület rohamosan fejlődik hiszen az ilyen jellegű vizsgálatok által alapvető fontosságú biológiai kérdésekre adhatunk választ [1].

Munkám során egy új módszert, az automatizált mikropipettát [2] alkalmaztam sejtpopulációk egyedi-sejt szintű adhéziós erő eloszlásának mérésére, illetve egy olyan modell rendszert fejlesztettem ki, amely a kapott erő értékékek lehető legpontosabb meghatározását teszi lehetővé. A rendszer mikroszkopikus méretű polisztirol gyöngyök felületének avidin-biotin kötésen keresztüli kémiai funkcionalizálásán alapul. A beállított nyomáskülönbség által a sejtre kifejtett erőt numerikus szimulációk segítségével határoztuk meg. Mivel a szimuláció eredménye függ a modell rendszer geometriájától, optikai hullámvezető spektroszkópiával karakterizáltuk a gyöngyök és a felszín közötti kontaktust és az abban lévő kötések számát. A mért erő kalibrációjához egy szintén új, atomerő-mikroszkópián (AFM) alapuló módszert , a FluidFM-et alkalmaztam. A technika lényege, hogy egy mikrofluidikai csatornával ellátott AFM mérőfejjel sejteket vagy mikroszkopikus részecskéket választunk el az aljzattól miközben mérjük a fellépő tapadási erőt.

A két módszer alkalmazása által kapott erőspektrumok jó egyezést mutattak így beláttuk, hogy a mikropipettás módszer lényegében a kolloid erőspektroszkópia magas áteresztőképességű verziójaként alkalmazható bármilyen biológiai vagy általános molekuláris kölcsönhatás erősségének mérésére. Demonstráljuk továbbá, hogy a gyöngyfelületet eukarióta vagy bakteriális felületi motívumokkal bevonva képesek vagyunk megmérni az egyes felületi komponensek hozzájárulását az adhéziós folyamatokhoz

Irodalom

[1] Ungai-Salánki, R., Peter, B., Gerecsei, T., Orgovan, N., Horvath, R., & Szabó, B. (2019). A practical review on the measurement tools for cellular adhesion force. Advances in Colloid and Interface Science.

[2] Ungai-Salánki, R., Gerecsei, T., Fürjes, P., Orgovan, N., Sándor, N., Holczer, E., ... & Szabó, B. (2016). Automated single cell isolation from suspension with computer vision. Scientific reports, 6, 20375.

09:45 – 10:00

Husztiné Nagy Georgina
Magnetit-kötő flagelláris filamentumok kötési tulajdonságainak vizsgálata eltérő morfológiájú magnetit nanorészecskékkel

E27

Magnetit-kötő flagelláris filamentumok kötési tulajdonságainak vizsgálata eltérő morfológiájú magnetit nanorészecskékkel

Nagy Georgina, Papp Lejla, Pósfai Mihály, Vonderviszt Ferenc

Pannon Egyetem, Bio-nanotechnológiai és Műszaki Kémiai Kutatóintézet

A mágneses nanorészecskék felhasználása igen széleskörű, számos műszaki és orvostudományi alkalmazásuk ismert. A mágneses nanokristályok alakja és mérete az adott alkalmazás szempontjából lényeges, ám szabályozása nem egyszerű. A magnetit kristályok egyensúlyi morfológiája az oktaéder, különböző laboratóriumi szintézis módszerekkel azonban ettől eltérő, pl. kocka alak is kialakítható.

Kutatómunkánk célja az volt, hogy biológiai templáton különböző morfológiájú mágneses nanorészecskéket felhasználva egyenletes borítottságú mágneses nanoszálakat állítsunk elő, és hogy megvizsgáljuk, van-e különbség az eltérő morfológiájú kristályok filamentumokhoz való kötődésében.

Ennek első lépéseként a baktériumok flagelláris filamentumait felépítő fehérje alegység, a flagellin felszíni doménjét módosítottuk génsebészeti módszerekkel, és ezáltal olyan variánsokat alkottunk, melyekbe a magnetit nukleációjában és/vagy megkötésében szerepet játszó oligopeptideket építettünk be.

Szelekciós eljárással kiválasztottuk azokat a variánsokat, amelyek a legnagyobb affinitással képesek a különböző magnetit részecskéket felszínükön kötni. A legnagyobb kötési affinitást egy magnetoszóma membránfehérje, a MamI kötőrégiója, valamint egy szintetikus peptid, az IB2 mutatta.

Valamennyi variáns esetében vizsgáltuk a kötési tulajdonságokat mind az oktaéder, mind a kocka magnetit jelenlétében transzmissziós elektronmikroszkóp segítségével. A kocka alakú magnetittel egyenletesebb borítást értünk el a filamentumok felületén, mint az oktaéderes alakúakkal.

Köszönetnyilvánítás

A kutatómunkát az ERA-CHEMISTRY NN-117642 és a BIONANO_GINOP-2.3.2-15-2016-00017 projektek támogatták.

Bioenergetika és fotobiofizika

Aug 28 - szerda

10:30 – 12:00

Elnök: Zimányi László, Csík Gabriella

10:30 – 10:50

Bartók Ádám
A MICU1 fehérje szerepe neuronok mitokondriális Ca2+ homeosztázisában és túlélésében

E28

A MICU1 fehérje szerepe neuronok mitokondriális Ca2+ homeosztázisában és túlélésében

Bartók Ádám1,2, Raghavendra Singh2, Hajnóczky György2

1 Semmelweis Egyetem Orvosi Biokémiai Intézet

2 MitoCare Center, Dept. of Pathology, Anatomy and Cell Biology, Thomas Jefferson University, Philadelphia PA

A mitokondriális Ca2+ homeosztázis a sejt energia termelésének, a sejthalál mechanizmusának és az intracelluláris Ca2+ jelek kialakulásának egyaránt elengedhetetlen szabályozó eleme. A MICU1 egy, a mitokondriális Ca2+ uniporter (MCU) működését szabályozó intermembrán térben elhelyezkedő fehérje, mely a mitokondriális Ca2+ felvétel extramitokondriális Ca2+ szint általi szabályozását biztosítja. Ez a szabályozás kettős természetű, azaz alacsony Ca2+ szint mellett a MICU1 fehérje az MCU zárva tartásával a mitokondriális Ca2+ felvételt gátolja, míg az ER/SR felől érkező Ca2+ jel hatására az MCU aktiválásával a mitokondriális Ca2+ felvételt segíti elő. A MICU1 fehérje génjének funkcióvesztéses mutációja humán betegekben progresszív tanulási zavar, izomgyengeség, krónikus fáradtság és mozgási rendellenességek kialakulásához vezet.

A MICU1 működésének pontosabb megértéséhez létrehoztunk egy neuron specifikus MICU1-KO egér vonalat. Élő állaton végzett viselkedési tesztekkel a humán betegeknél leírtakhoz hasonló, progresszív tanulási és mozgási rendellenességeket mutattunk ki. Szövettani vizsgálatokkal a gerincvelőben csökkent motor neuron számot, míg a motoros kéregben a dendritikus nyúlványok megváltozott morfológiáját találtuk. Ex vivo növesztett kortikális neuronokban megváltozott citoszolikus és mitokondriális Ca2+ jeleket mértünk, mely a MICU1-KO sejtek fokozott elhalásához vezetett excitotoxikus stimuláció alkalmazása esetén. Humán betegekből izolált fibroblasztok és limfoblasztok szintén megváltozott mitokondriális Ca2+ homeosztázist és emelkedett sejthalálozást mutattak. Eredményeink alátámasztják azt a feltevést, hogy a humán betegekben a MICU1 hiányában a neuronokban megváltozott mitokondriális Ca2+ homeosztázis következménye a neurodegeneráció, és az azt kísérő progresszív kognitív és mozgási zavarok kialakulása.

Köszönetnyilvánítás

Bartók Ádám a Tempus Közalapítvány által nyújtott Magyar Állami Eötvös Ösztöndíj támogatásában részesült.

10:50 – 11:10

Maróti Péter
A gerjesztési energia vándorlása fotoszintetizáló baktériumok antennájában

E29

A gerjesztési energia vándorlása fotoszintetizáló baktériumok antennájában

Maróti Péter1*, Iglói Ferenc2,3, Kis Mariann1, Kovács István3 és Smart James4*

1Szegedi Tudományegyetem TTIK-ÁOK Orvosi Fizikai Intézet

2Szegedi Tudományegyetem TTIK Elméleti Fizikai Intézet

3MTA SZFKI Budapest

4Tennessee Egyetem Biológiai Intézet, Martin, USA

*email: pmaroti@sol.cc.u-szeged.hu

A fotoszintetikus egységek (PSU) közötti gerjesztési energia átadása klasszikus Joliot (később Lavergne-Trissl) elmélete [1] hiányosságainak felderítésére Rba. sphaeroides fotoszintetizáló baktériumokon párhuzamosan mértük a fluoreszcencia hatásfokának (φ) emelkedését és a reakciócentrumok (RC) bezáródását (az oxidált dimer mennyiségét, [P+]-t) gerjesztő fény hatására (indukció, [2]), valamint ezt követően sötétben φ lecsengését és a bezárt RC-ok fokozatos kinyitását (relaxáció, [3]). A RC többszöri átfordulásának kiküszöbölésére olyan mutánst (cycA) állítottunk elő, amelyből hiányoznak a P+ gyors visszaredukálásáért felelős citokrómok [4]. A kinetikákból meghatározott φ vs. [P+] függvények nyilvánvaló eltéréseket mutatnak a Joliot-elméletből számítottakkal: 1) az indukcióban és relaxációban mért görbék különböznek, 2) a 0<p<1 csatolási paraméter nem állandó, hanem a nyitott/zárt PSU-k arányától függ, 3) a hiperbola nem merőleges szárú, és 4) mérési pontok szisztematikusan eltérnek a számított görbéktől. A megfigyelt eltéréseket azzal magyarázzuk, hogy 1) a gerjesztési energia az élettartama alatt a PSU-k által meghatározott négyzetrácson bolyong, 2) a zárt PSU-k térbeli eloszlása nem marad véletlenszerű az indukció során (mint ahogy azt a Joliot elmélet feltételezi), hanem csomósodások lépnek fel a PSU-k közötti energetikai csatolás miatt.

[1] de Rivoyre M, Ginet N, Bouyer P, Lavergne J (2010) BBA 1797:1780-1794.

[2] Maróti P (2016) In: Handbook of Photosynthesis, Pessarakli (ed) 3rd ed. pp 463-483 CRC Press, Boca Raton.

[3] Asztalos E, Sipka G, Maróti P (2014) Photosynth Res 124:31-44.

[4] Sipka G, Kis M, Smart JL, Maróti P (2018) Photosynthetica 56(1):125-131

A munka az EFOP-3.6.2-16-2017-00001 támogatásával készült.

11:10 – 11:30

Lambrev Petar
Exciton–radical-pair equilibration in Photosystem II observed by two-dimensional electronic spectroscopy

E30

Exciton–radical-pair equilibration in Photosystem II observed by two-dimensional electronic spectroscopy

Petar Lambrev1, Parveen Akhtar1,2, Pawel Nowakowski3, Gábor Sipka1, Guangye Han4, Jian-Ren5 Shen, Győző Garab1, Howe-Siang Tan3

1 Biological Research Centre HAS, Plant Biology Institute

2 ELI-ALPS, ELI Nonprofit Ltd.

3 Nanyang Technological University, School of Physical and Mathematical Sciences, Singapore

4 Photosynthesis Research Center, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

5 Photosynthesis Research Center, Okayama University, Okayama, Japan

The kinetics of energy transfer and charge separation in isolated Photosystem II (PSII) core complexes was studied by time-resolved fluorescence, femtosecond transient absorption and two-dimensional electronic spectroscopy (2DES). Time-resolved fluorescence showed that the main excited-state deactivation time constant in PSII with open reaction centres is around 40 ps, in accordance with literature results. Global analysis of the transient absorption data revealed lifetimes of 200 fs and 3–4 ps (assigned mainly to energy equilibration among antenna chlorophylls), 35–40 ps (the main photochemical trapping), 200–250 ps (electron transfer from pheophytin to QA) and a nanosecond component (re-reduction of P680+). The transient spectra of the reduced pheophytin and oxidized P680 are well defined. These data are in excellent agreement with previous results. 2DES, performed under identical excitation conditions, further resolved uphill and downhill pathways of energy transfer in the antenna as well as equilibration between the primary radical pair and the antenna occurring on a sub-picosecond timescale. The results bring new evidence supporting the exciton–radical-pair equilibrium model of PSII kinetics.

Acknowledgements

The work was supported by grants from the Hungarian Ministry of Finance (GINOP-2.3.2-15-2016-00001), the National Research, Development and Innovation Office (NKFIH NN 124904; 2018-1.2.1-NKP-2018-00009), and the Singapore Ministry of Education Academic Research Fund (Tier 2 MOE2015-T2-039).

11:30 – 11:45

Solymosi Katalin
Sóstressz illetve ozmotikus stressz hatása a fotoszintetikus apparátus kialakulására és működésére

E31

Sóstressz illetve ozmotikus stressz hatása a fotoszintetikus apparátus kialakulására és működésére

Sóti Adél1, Ounoki Roumaissa1, Kósa Annamária1, Beata Mysliwa-Kurdziel2 és Solymosi Katalin1

1 ELTE – Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Növényszervezettani Tanszék

2 Krakkói Jagelló Egyetem, Növényélettani és Biokémiai Tanszék

A nem megfelelő talajmegművelési és öntözési eljárások következtében Földünk mezőgazdaságilag megművelhető területének egyre jelentősebb részén (egyes becslések szerint közel 800 millió hektáron) okoz gondot a talaj magas sókoncentrációja [1]. A talajban felhalmozódó káros ionok a legtöbb termesztett növényünk fejlődését és terméshozamát negatívan befolyásolják. A sóstressz komplex módon hat a növények anyagcseréjére és élettani folyamataira. Rövidtávon hiperozmotikus stresszt okoz, amelynek következtében csökken a vízpotenciál, és így a növény vízfelvétele és a sejtek növekedése is gátolt, hosszabb távon pedig az egyes szervekben, szövetekben, sejtekben illetve sejtalkotókban felhalmozódó ionok (Na+ és Cl-) specifikus toxikus hatásai kerülhetnek előtérbe [2].

Munkánk során azonos ozmolaritású só- (600 mM NaCl:KCl, 1:1) illetve polietilén-glikol (PEG) oldat hatását vizsgáltuk egy hazai búzafajta (Triticum aestivum L. Mv. Béres) sötétben nevelt csíranövényeinek levelében található színtestekre, a bennük zajló klorofill szintézisre és fokozatos zöldülésre. Már pár órás kezelés is a tilakoidmembránok specifikus és ionok által indukált duzzadását okozza a sóstresszelt mintában, míg a PEG kezelés hatásai kevésbé szembetűnők. A klorofill bioszintézise és a fotoszintetikus apparátus kiépülése és működése, a kloroplasztiszok fejlődése teljes mértékben gátolt volt a sóoldaton, míg a pusztán hiperozmotikus stresszt előidéző PEG oldaton, ha valamivel lassabban is, de mindkét folyamat végbement. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a klorofill bioszintézist és a zöldülést a sóstressz specifikus ionos komponense(i) gátoljá(k), önmagában az ozmotikus stressz kevésbé hat rá negatívan.

Köszönetnyilvánítás

A kutatásokat az OTKA (FK 124748) és az MTA Bolyai János kutatási ösztöndíja (S.K.) támogatta.

Irodalom

[1] FAO (2015) FAO Land and Plant Nutrition Management Service. Rome.

[2] Maathuis FJM, Ahmad I, Patishtan J (2014) Front Plant Sci 5: 467.

11:45 – 12:00

Groma Géza
Fényindukált komplex folyamatok kinetikai modellezése gépi tanulás módszerével

E32

Fényindukált komplex folyamatok kinetikai modellezése gépi tanulás módszerével

Groma Géza, Sarlós Ferenc, Sipos Áron, Nagypál Rita, Nagy Dávid, Dér András, Zimányi László

MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

A biológiai mintákon végzett időbontott spektroszkópiai vizsgálatok jelentős része elsőrendű kinetikák komplex rendszerével írható le [1]. Ilyenek a különböző konformációs állapotban levő FAD vagy NADH molekulákból származó fluoreszcencia kinetikák, valamint a retinál fehérjék és a fotoszintetikus rendszerek fényindukált folyamatainak kinetikái. Noha e folyamatok leggyakrabban exponenciális függvények összegével írhatók le, a modellezésnél súlyos nehézségeket okoz, hogy (1) a sokszor több nagyságrendet átfogó időtartományon kevés mérési pont áll rendelkezésre, (2) a komponensek számát nem ismerjük előre, (3) az exponenciális illesztés instabil probléma: kis bemeneti zaj is nagy bizonytalanságot eredményezhet a paraméterekben, (4) nem garantált a globális illesztési minimum elérése.

Megmutatjuk, hogy a fenti problémák elkerülhetők a modern statisztika két módszerének alkalmazásával. Egyrészt a kis- (és ismeretlen) számú exponenciális illesztése helyett az időállandók egy nagyszámú, kvázifolytonos halmazán keresünk ritka (sparse) megoldásokat, azaz olyan eloszlásokat, amelyek csak néhány pontban különböznek zérustól [2]. Másrészt a ritkaság mértékét szabályzó hiperparaméter(eke)t az adott zajszintnek megfelelően választjuk ki, valamely resampling technikán (pl. cross-validation) alapuló gépi tanulás (Bayesian Optimization) útján. Ez az eljárás automatikusan optimalizál a kevés paraméterrel való gyenge illesztés (high bias) és a sok paraméterrel való zajra illesztés (high variance) között.

A fenti eljárást elsőként alkalmaztuk komplex elsőrendű kinetikák modellezésére. Eredményességét a bakteriorodopszin fotociklus és a FAD fluoreszcencia kinetikáin fellépő Hofmester effektus tanulmányozásán mutatjuk be.

Köszönetnyilvánítás

Ez a munka az NKFIH GINOP-2.3.2-15-2016-00001 projekt támogatásával készült.

Irodalom

[1] van Stokkum IHM, Larsen DS, van Grondelle,R (2004) Biochim Biophys Acta 1657: 82−104.

[2] Groma GI, Heiner Z, Makai A Sarlos F (2012) RSC Adv 2: 11481−11490.

II. Poszterszekció (P32-P58)

Aug 28 - szerda

13:30 – 15:30

Vozáry Eszter
Melegítés hatása a magyar akácmézek dielektromos tulajdonságaira

P53

Melegítés hatása a magyar akácmézek dielektromos tulajdonságaira

Vozáry Eszter1, Bodor Zsanett1, Ignácz Kinga1, Gillay Bíborka1 és Kovács Zoltán1

1 Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar Fizika-Automatika Tanszék

A méz természetes, egészséges táplálék, amely gazdag biológiai aktív vegyületekben. A mézet a kaptárból történő kinyerésekor, valamint csomagoláskor felmelegítik. A melegítés hőfoka a feldolgozás során nem lehet magas -50-60 °C – a méz fajtájától függően, mert magas hőmérsékleten károsodnak a biológiailag hatékony anyagok. A melegítés során a méz természetes mikrokristályos szerkezete megolvad, majd a visszahűtés esetén más kristályos szerkezet (nagyobb kristály méretek) alakul ki. A korábbi felmelegítés kimutatására eddig általában kémiai módszereket használtak, amelyek lassúak és anyagigényesek. Várható, hogy a méz melegítése és visszahűtése során létrejövő szerkezet változás miatt a nem melegített méz elektromos impedancia spektruma különbözik a felmelegített és visszahűtött méz spektrumától.

Négy különböző akácméz elektromos impedancia spektrumát határoztuk meg melegítés előtt. Majd 35, 40, 50, 60 és 80 °C-ra melegítettük a mézeket, és 0.5, 4 és 24 órán át tartottuk magas hőmérsékleten, majd visszahűtve megint megmértük az impedancia spektrumokat. Egy minta tömege 40 g volt és fedéllel ellátott üvegedényben melegítettük fel. Az elektromos impedancia spektrumokat egy HP4384A és egy HP4385A precíziós LCR mérővel mértük meg két 1 cm távolságban levő Ag/AgCl elektróda között 1 volt feszültségnél 30 Hz - 30 MHz frekvencia tartományban. A mért spektrumokat rövidzár-szakadás korrekció (szórt induktivitások és kapacitások kiküszöbölése) után egy elosztott paraméterű elem és egy ohmos ellenállás soros kapcsolatából álló modell áramkörrel közelítettük az Excel Solver funkciójával. Minden mézre a modell paraméterek közül az elosztott paraméterű elem ellenállása csökkent a melegítés és visszahűtés után. Ez a paraméter alkalmas lehet a melegítés kimutatására.

Köszönetnyilvánítás

A Szent István Egyetem Élelmiszer tudományi Doktori Iskolája, az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00005 Európai Alapítvány és az Új Nemzeti Kiválósági Program UNKP-18-4 támogatta ezt a munkát

Szöllősi Dávid
Hatékony képminőség javító algoritmus digitális variancia angiográfiához

P58

Hatékony képminőség javító algoritmus digitális variancia angiográfiához

Szöllősi Dávid1,2, Gyánó Marcell1,3, Óriás Viktor Imre1,3,4, Osváth Szabolcs1,2, Sótonyi Péter3, Szigeti Krisztián 1,2

1 Kinepict Health Kft;

2 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet;

3 Semmelweis Egyetem, Városmajori Szív- és Érgyógyászati Klinika;

4 Bács-Kiskun Megyei Kórház

A digitalis variancia angiográfia (DVA) a kinetikus képalkotás Röntgen angiográfiás képsorozatokra való alkalmazásán alapul. A betegbiztonság és az eljárás költséghatékonyságának javítását a képminőség korlátozza: a jobb képminőség (pl.: nagyobb kontraszt/zaj arány (CNR), kevesebb műtermék) lehetőséget nyújt, hogy a beavatkozás során alkalmazott ionizáló sugárzás dózisát és a beadott kontrasztanyag mennyiségét csökkentsük.

Célunk kidolgozni egy olyan képfeldolgozó algoritmust, mely csökkenti a mozgási műtermékeket és javítja a DVA képek kontrasztját, az erek láthatóságát.

Egy időbeli differenciáláson alapuló algoritmust (DVA+) fejlesztettünk és implementáltunk Matlab-ban (Matlab 2016a, Mathworks). Az algoritmus teljesítményének felmérése céljából 30 páciens hasi és alsó végtagi Röntgen angiográfiás képsorozatából hoztunk létre DVA és DVA+ képeket. Vaszkuláris és perivaszkuláris régiókat (ROIkat) jelöltünk ki (n=3283) kézzel egy ImageJ makró segítségével. A CNR-t a kontraszt (vaszkuláris és perivaszkuláris ROI átlag intenzitásának különbsége) és a perivaszkuláris háttér ROI szórásának arányaként számoltuk ki.

A DVA képek medián CNR értéke 9.26 (Q1: 4.90, Q3:15.86) volt, míg a DVA+ képek medián CNR értéke 14.44 (Q1: 7.14, Q3: 26.00). Az azonos ROI párok CNR értékeinek medián aránya (DVA+/DVA) 1.49 (Q1: 1.12, Q3: 2.02) volt.

A DVA+ egy hatékony algoritmus a kinetikus képalkotáson alapuló Röntgen angiográfiás képek kontraszt/zaj arányának javítására.

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Kaposi András
Koleszterin és oldható tumormarkerek (CEA és szindekán-2) alkalmazása mellüregi folyadékgyülemek daganatdiagnosztikájában

P57

Koleszterin és oldható tumormarkerek (CEA és szindekán-2) alkalmazása mellüregi folyadékgyülemek daganatdiagnosztikájában 

Gulyás Miklós1, Fillinger János2, Kaposi András3 és Molnár Miklós4

1 Immunology, Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, Uppsala University

2 Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet

3 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

4 Semmelweis Egyetem, Kórélettani Intézet

A tumormarkereket 247 betegnél a mellüregi folyadékgyülemek felülúszójában mértük, amelyből 126 esetben volt a pleura rosszindulatú daganatos érintettsége.

A szindekán-2 a mesotheliomás esetekben ugyan megemelkedett koncentrációban van jelen, de a különböző kóros állapotok közötti különbségtételre alkalmatlan. Az 5 ng/mL-es határértéket meghaladó CEA-koncentrációk karcinómát jeleznek a vizsgált mintában 100%-os specificitással, viszont csak 62 %-os szenzitivitással. A koleszterin-koncentráció 1,21 mmól/L-nél nagyobb értékek esetén 99% -os érzékenységű és 69%-os specificitású diagnosztikus marker a neopláziás pleurális esetekre. A gyenge specificitás a jóindulatú gyulladásos esetekben is megemelkedő koleszterin érték miatt van. A kombinált emelkedett CEA és a koleszterin meghatározás növelte az érzékenységet a karcinomatózis diagnosztizálására a nem egyértelmű citológiai esetekben.

Egészen kiváló diagnosztikus marker a koleszterin, ha citológia segítségével vagy áramlási citometriával elkülönítjük a gyulladásos eseteket. A megemelkedett koleszterin gyulladás nélkül 99.2 %-os szenzitivitású, 98.8 % specificitású és 99.0%-os diagnosztikus effektivitású módszert eredményez a neopláziás pleurális esetekre.

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Hinnah Barbara
Kétpórusú káliumcsatornák porcképződésben betöltött szerepének vizsgálata mechanikailag ingerelt ’high density’ porckultúrákban patch-clamp módszerrel

P56

Kétpórusú káliumcsatornák porcképződésben betöltött szerepének vizsgálata mechanikailag ingerelt ’high density’ porckultúrákban patch-clamp módszerrel 

Hinnah Barbara1,2, Zákány Florina1, Szegeczki Vince2, Juhász Tamás2, Varga Zoltán1

1 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

2 Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet

A kétpórusú káliumcsatornák (K2P) két pórusdoménnel rendelkeznek, aktivitásukat különböző ingerek (pH, hőmérséklet, mechanikai stimulus, stb.) együttes jelenléte határozza meg. Számos K2P csatorna található a porcsejteken, közülük több expressziója a porcképződési folyamat során dinamikusan változik.

Célunk a K2P csatornák sejtfelszíni jelenlétének azonosítása és expressziójának összehasonlítása patch-clamp technika segítségével kontroll, illetve mechanikailag ingerelt (MS) porckultúrákon. Szelektív gátlószer hiányában az egyes ioncsatornák elkülönítéséhez különböző pH-jú külső oldatokat alkalmaztunk, mivel ismert, hogy a különböző K2P csatornák pH érzékenysége eltérő.

Kísérleteinket 22-24. Hamburger-Hamilton-féle fejlődési stádiumban lévő csirkeembriók végtagtelepeiből izolált primer ’high-density’ (HD) porckultúrákon végeztük. A MS a 2. és a 3. tenyésztési napon, míg a patch-clamp mérések teljes sejt konfigurációban a 3. napon történtek, amikor a chondroprogenitor sejtek differenciációja zajlik. A külső oldat pH-ját 7.32, 6.4 és 8.6 között változtattuk egy gravitáció által hajtott perfúziós rendszer segítségével.

A mérések során a 150 ms hosszúságú, -120 mV-tól +50 mV-ig terjedő feszültségrámpák által kiváltott ionáramok egy feszültség-független és több feszültségfüggő komponensből tevődtek össze. Előbbi a K2P csatornákhoz tartozik, míg utóbbiak a porcsejteken jól leírt NaV és KV áramok. A K2P ionáram megfordulási potenciálja kontroll sejteken -43,3 ± 2,9 mV (n=6), előzetesen mechanikailag ingerelt sejteken -65,4 ± 3,5 mV (n=4) volt. A 8.6-os pH-jú oldat a K2P áram amplitúdóját szignifikánsan lecsökkentette a kontroll oldathoz (pH=7.32) képest, ami részben reverzibilisnek bizonyult, míg a 6.4-es pH-jú oldat nem okozott változást.

Mivel a fenti válasz egyedül a TREK2 K2P csatornára jellemző, PCR és Western blot segítségével tovább vizsgáljuk a TREK2 expressziójának változását a porcképződés folyamata során kontroll és mechanikailag stimulált HD porckultúrákban.

Köszönetnyilvánítás: EFOP-3.6.2-16-2017-00006 LIVE LONGER

Deli Gábor
Vérlemezkék mitokondriális DNS-én végzett PCR vizsgálatok a röntgensugárzás károsító hatásának kimutatására

P55

Vérlemezkék mitokondriális DNS-én végzett PCR vizsgálatok a röntgensugárzás károsító hatásának kimutatására

Deli Gábor, Pataki Ágnes, Papp Sándor és Mátyus Mária

Tudományos Kutató és Laboratóriumi intézet, Magyar Honvédség Egészségügyi Központ, Budapest

Biodozimetriai analízisre a vér különösen alkalmas, mert nagyon komplex rendszer, bonyolult az összetétele, a benne lejátszódó folyamatok gyorsan változnak és detektálhatók. Az ionizáló sugárzás DNS károsító hatása régen ismert, kimutatását hagyományosan a dicentrikus kromoszómának megjelenése alapján végezzük. A mitokondriális DNS (mtDNS) is károsodik, a lánc lineáris lesz és degradálódik. Az mtDNS gyűrűvé visszazárása megállíthatja a folyamatot, de a korábbi veszteség miatt deléció jön létre. Munkánkban a leggyakrabban előforduló deléció változatot, a common deléciót [1] vizsgáltuk

A citrátos vákumcsőbe levett vérmintákat röntgen besugárzásnak vetettük alá, 0-1 Gy tartományban, 24 óra elteltével enyhe centrifugálásával előállítottuk a vérlemezke gazdag frakciót (PRP), melyből DNS-t izoláltunk. Ilyenkor számolni kell a vérplazmában lévő szabad és a vérlemezke felszínén expresszálódó TLR9 receptorok által megkötött, más sejtekből származó mitokondriális DNS-sel is. Real time PCR mérést végeztünk, a primerpárok [2] egy, az mtDNS deléció helyén összekapcsolódott és egy delécióra kevésbé hajlamos mtDNS szakaszt sokszoroztak. A térfogategységben lévő mtDNS molekulák mennyiségének változását, valamint a common delécióval rendelkezők arányát vizsgáltuk. Megfigyeltük, hogy a 0,5 Gy alatti tartományban az értékek emelkedtek, de 1 Gy érték körül újra az alapszintet mértük. Irodalmi adatok alapján [3] feltételezzük, hogy mitofágia vagy apoptózis következtében degradálódik a deléciót tartalmazó mtDNS.

A vér a legkönnyebben hozzáférhető szövetünk, a vérlemezkék molekuláris biológiai monitorozása alkalmas lehet az elszenvedett besugárzás tényének gyors megállapítására. Ennek bizonyítására további vizsgálatokra van szükség.

Irodalom

[1] Rogounovitch, T I, et al (2002) Cancer Research 62, 7031–7041.

[2] Schilling-Tóth, B, et al (2011) Mutation Research 716, 33– 39.

[3] Kubli, D A and Gustafsson, A B (2012) Circ Res. 111, 1208–1221.

Antal Lilla
Humán plazma eredetű extracelluláris vezikulák izolálási módszereinek összehasonlítása

P54

Humán plazma eredetű extracelluláris vezikulák izolálási módszereinek összehasonlítása 

Antal Lilla1, Balázs Katalin1, Kis Dávid1, Mihály Judith2, Persa Eszter1, Sándor Nikolett1, Szatmári Tünde1, Lumniczky Katalin1

1 Nemzeti Népegészségügyi Központ, Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Főosztály, Sugárorvostani osztály

2Magyar Tudományos Akadémia, Természettudományi Kutatóközpont, Anyag és Környezetkémiai Intézet, Biológiai Nanokémia Kutatócsoport

Az extracelluláris vezikulák sejtekből származó, membránnal körülvett struktúrák. Termelődésük legalább olyan általános sejtbiológiai jelenség, mint a sejtosztódás, a sejtmozgás vagy a programozott sejthalál. Működésük lehetővé teszi a fehérjék, RNS-ek, sőt DNS-ek sejtek közötti kicserélődését. Extracelluláris vezikulákat mind az egészséges, mind a daganatos sejtek termelnek. A tumoros sejtek által termelt extracelluláris vezikulák mennyiségét és a bennük szállított mikro-RNS profilját vizsgálva a normális sejttől eltérő mikro-RNS-profilt találtak. A megnövekedett mennyiségű extracelluláris vezikula által lehetőség nyílik a tumorasszociált jelátviteli molekulák és mikro-RNS-ek célsejthez való eljutásának vizsgálatára, ami a daganatos állapotok progressziójában is valószínűsíti jelentőségüket. Az extracelluláris vezikulák vérplazmában mért mennyisége, a terápia során megfigyelt minőségi változása miatt felmerült, hogy a diagnosztikában, prognosztikában, illetve a minimális reziduális betegség monitorozásában is használhatók lehetnek.

Kutatásom célja humán prosztatarákos betegek fagyasztott plazmájából származó extracelluláris vezikulák felszíni markereinek és beltartalmának vizsgálata, azon belül mikro-RNS tartalmának jellemzése. Az említett vizsgálatokhoz megfelelő tisztaságú és mennyiségű izolált extracelluláris vezikula mintákra van szükségem. Ennek érdekében jelen tanulmányban négy különböző, a tudományos világban gyakran használt izolálási módszert hasonlítok össze: ultracentrifugálás, IZON qEV, ExoQuick ULTRA és PLUS. A módszerek összehasonlításához használt kontroll minta egészséges fagyasztott humán plazma volt. A kiválasztott módszerekkel izolált extracelluláris vezikulákat tisztaságuk, méretük és mennyiségük alapján jellemeztem. A kapott eredmények összehasonlítása alapján kiválasztottam a további vizsgálataimhoz legmegfelelőbb technikát.

Ez a munka az EU által finanszírozott CONCERT (662287) és az NKFIH által finanszírozott OTKA (124879) projektek támogatásával valósult meg.

Vizsnyiczai Gaszton
Don’t be a fool, use a microtool: Biophotonic toolbox for single cell studies

P52

Don’t be a fool, use a microtool: Biophotonic toolbox for single cell studies 

Gaszton Vizsnyiczai1, Tamás Fekete1, Mária Mészáros1, András Búzás1, Gergely Iványi1, Ádám Apró1, Pál Ormos1, Rebeca Martínez Vázquez2 and Lóránd Kelemen1

1 Biological Research Centre, Institute of Biophysics, Hungarian Academy of Sciences, Temesvári krt. 62, 6726 Szeged, Hungary

2 Institute for Photonics and Nanotechnologies, National Research Council, Piazza Leonardo da Vinci, 32, 20133 Milan, Italy

Microfluidics has revolutionized biological research due to its capabilities that enables measurements in extremely small volumes in a highly parallelized and integrated manner, for a relatively low cost. Considering cell studies in a microfluidic system, engineered microenvironments can add extra possibilities to the experiments: besides the plain walls, geometrical or chemical modifications, or even microdevices can be created inside the microfluidic channels. Here we introduce an assortment of microstructures and tools we have created, tested and offer for single cell studies in microchannels. These include channel-attached as well as mobile devices which can be actuated with optical tweezers, as follows.

We fabricated microslits with sub-micrometer opening to study cancer cell migration through confined spaces.

An integrated whispering-gallery mode detector was made inside a microchannel and the presence of protein was detected with it in micromolar concentration in a selective way.

The overall deformability of a single cell can be measured with a two-arm micro lever that can multiply the force the optical tweezers exerts.

Local cell deformability and its Young-modulus were obtained with an optically actuated microtool that can make small indentation on the cell membrane.

A similar tool with functionalized surface is used to test adhesion forces of various ligands to their corresponding membrane-bound receptors.

Multiview microscopic imaging of single cell was performed using microtools that are attached to the cells enabling their indirect optical manipulation; in cases when attachment is not possible, two manipulators can be used to grab and move a cell.

We plan to extend our fluorescent microscopic system which is outfitted with the optical trap towards light sheet excitation to improve image equality and data collection speed. One of our planned biological applications is to study single cell interactions between various fungi species and immune cells.

Acknowledgements

This work was supported by funding received from the CONCERT-Japan Photonic Manufacturing Joint Call (FEASIBLE project), GINOP-2.3.2-15- 2016-00001, GINOP-2.3.3-15-2016-00040 and the European Union's Horizon 2020 Research and Innovation Programme under grant agreement No. 654148 Laserlab-Europe.

Sziklai Dominik
A szarkomerikus M-komplex nanosebészeti analízise

P51

A szarkomerikus M-komplex nanosebészeti analízise

Sziklai Dominik1, Kellermayer Miklós1 és Mártonfalvi Zsolt1

1 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet, Budapest

Az izomszarkomer, állandó erőhatás ellenére megtartja szerkezetét, integritását. Ebben fontos szerepet játszik a középvonalában húzódó M-csík, mely miozin filamentumok centrális régióiból, a titin átlapoló szakaszaiból és asszociált fehérjékből felépülő struktúra. Feltételezzük, hogy az M-csík szerkezeti egysége a vastag filamentumhoz asszociált titinmolekulák fej-fej irányú oligomerizációjából kialakuló M-komplex. Kutatásunkban az M-komplex szerkezeti és nanomechanikai feltárását végeztük. Az M-komplexet oligomerizálódott titinmolekulákon vizsgáltuk. A titint nyúl hátizomból izoláltuk, fehérje-extrakciós, kicsapási, centrifugálási és kromatográfiás lépésekkel. Az M-komplexeket csillámfelületre adszorbeálást követően atomi erőmikroszkóppal (AFM) vizsgáltuk. Az M-komplex a pontszimmetrikus titin oligomér centrális, ~40 nm átmérőjű globuláris eleme, melyhez leggyakrabban 12, sugárirányból kapcsolódó titinmolekula asszociálódott, összhangban a modellel, miszerint egy miozin vastag filamentum mindkét végéhez 6-6 titin kapcsolódik. Az oligomerizálódott titinmolekulák hosszát 500 nm-nek mértük, a titin monomerek hosszát 782 nm-nek. A szerkezetet és nanomechanikát molekuláris nanosebészeti módszerrel tártuk fel: az AFM tűt ~1 nN erővel az M-komplexbe nyomtuk, majd azt a tű mozgatásával szétszálaztuk. Változtattuk a tű mozgásának irányát (1-360˚), sebességét (5-100 nm/sec) és amplitúdóját (10-300 nm). Az M-komplexekből ~0,3 nm átmérőjű, 50-200 nm kontúrhosszú, filamentális képleteket húztunk ki, amely arra utal, hogy a komplexben extenzibilis molekuláris rezervoár található. A túlnyújtott szálak 2-3x-os megnyúlás után szakadtak el. Az M-komplex nanosebészeti beavatkozás előtti és utáni térfogatait összehasonlítva átlagosan 50%-os növekedést tapasztaltunk, miszerint nem csupán rugalmas alakváltozás, hanem szerkezetváltozás, fehérje-kigombolyodás lépett fel. A nanosebészettel sikerrel tártuk fel a bonyolult szerkezetű M-komplex néhány nanofizikai tulajdonságát.

A kutatást az Innovációs és Technológiai Minisztérium Felsőoktatási Intézményi Kiválósági Programja támogatta, a Semmelweis Egyetem Terápiás célú fejlesztés tématerületi programja keretében.

Péter Beatrix
Kis molekulák és nanorészecskék élő sejtekre gyakorolt hatásának vizsgálata jelölésmentes bioszenzorral

P50

Kis molekulák és nanorészecskék élő sejtekre gyakorolt hatásának vizsgálata jelölésmentes bioszenzorral

Péter Beatrix1, Székács Inna1, Hideyuki Nakanishi2, Lagzi István3, Bősze Szilvia4, Horváth Róbert1

1 MTA EK MFA Nanobioszenzorika Lendület Kutatócsoport

2 Kyoto Institute of Technology (KIT), Japán

3 BME TTK Fizika Tanszék

4 MTA-ELTE Peptidkémiai Intézet

A jelölésmentes bioszenzorok- és képalkotó technikák robbanásszerű fejlődésen mentek keresztül az utóbbi években; alkalmazásuk a biológiai alapkutatásokban csak most kezdődött el, a műszerek egyre érzékenyebbek, használatuk új utakat nyithat meg a biotechnológiai alkalmazásokban is. Az említett módszerek fontos előnye, hogy a méréseket valós időben, jelölő anyagok, festékek nélkül tudjuk megvalósítani, így ezek nem befolyásolják a vizsgált mintákat.

Kísérleteinkben Epic BT (RWG) jelölésmentes optikai bioszenzort alkalmaztunk a kis molekulájú epigallokatekin-gallát (EGCG, zöld tea polifenol) élő sejtekre (HeLa sejtvonal) gyakorolt hatásának vizsgálatára kopolimer bevonatokon, valós időben. Különös figyelmet fordítottunk az EGCGszakirodalomban alig részletezett oxidált formájára, és feltártuk, hogy ez az oxidált forma hogyan befolyásolja a sejtadhéziós bevonatok tulajdonságát, ezáltal a sejtek működését, adhézióját és morfológiáját közvetett módon. A módszer nagy előnye, hogy a kis molekulák és a sokkal nagyobb sejtek egyszerűen, nagy érzékenységgel vizsgálhatók egyazon kísérletben [1]. A polifenol közvetlen hatását is megfigyeltük úgy, hogy a sejteket előkezeltük a hatóanyaggal, és ezután figyeltük meg a sejtek adhéziós kinetikáját [2].

Az orvostudomány többek között nanoméretű részecskék segítségével igyekszik megoldást nyújtani a hatóanyagok kizárólag a célsejtekbe történő bejuttatására. Ezen irányvonalat felvéve pozitívan töltött TMA-funkcionalizált arany nanorészecskék HeLa sejtekbe hatolását kísértük figyelemmel a már említett bioszenzor segítségével valós időben [3].

A fenti eredményeinkkel először mutattuk meg, hogy a bioszenzoros mérések hozzájárulhatnak a természetes hatóanyagokat szállító nanorészecskék felületi rétegének az optimalizálásához is, a minél hatékonyabb hatóanyag-bejuttatás érdekében.

Köszönetnyilvánítás

Ez a munka a Lendület, ERC_HU és a KH_17 (NKFIH), K104275 és a MedinProt támogatásával készült.

Irodalom

[1] Peter B, Farkas E, Forgacs E, Saftics A, Kovacs B, Kurunczi S, Szekacs I, Csampai A, Bosze Sz, Horvath R (2017) Sci. Rep. 7: 42220.

[2] Peter B, Ungai-Salánki R, Szabó B, Nagy AG, Szekacs I, Bősze Sz, Horvath R (2018) ACS Omega 3: 3882–3891.

[3] Peter B, Lagzi I, Teraji S, Nakanishi H, Cervenak L, Zámbó D, Deák A, Molnár K, Truszka M, Szekacs I, Horvath R (2018) ACS Appl. Mater. Interfaces 10: 26841–26850.

Kitka Diána
Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

P49

Extracelluláris vezikula koncentráció meghatározása humán vérplazmában és szérumban on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfiával és mikrofluidikus ellenállás impulzus méréssel

Kitka Diána1, Mihály Judith1, Varga Zoltán1

1 Magyar Tudományos Akadémia Természettudományi Kutatóközpont, Anyag-és Környezetkémiai Intézet

Az élő sejtek közötti kommunikáció egyik újonnan felfedezett útvonala az ún. extracelluláris vezikulákon (EVken) keresztüli információcsere, amely az elmúlt évtizedben a kutatások középpontjába került. Az EVk olyan, a sejten kívüli térben található, kettős foszfolipid membránnal határolt, sejt eredetű (nano)struktúrák, amelyek számos információt hordoznak a kibocsátó sejt állapotáról. Az EVk mennyisége és fajtái nagyban függnek az adott egyén fiziológiás és patológiás állapotától, így betegségek korai EV-alapú diagnosztizálása is lehetségessé válhat. A vér az egyik legnagyobb intermedier közeg és egyben a legfontosabb biomarker forrás, ugyanakkor EVk izolálása, detektálása és jellemzése ebből a komplex mátrixból számos nehézségbe ütközik.

Munkánk célja humán vérből izolált EVk meghatározása és jellemzése olyan újszerű technikákkal, mint az on-line fluoreszcenciás detektálással kombinált méretkizárásos kromatográfia (Flu-SEC) és a mikrofluidikus ellenállás impulzus mérés (MRPS).

A kísérletekhez egészséges önkéntesektől gyűjtöttünk vért szérum (szérum aktivárok) és plazma (K3EDTA, ACD-A) vérvételi csövekbe. A sejtes elemek eltávolítása két centrifugálási lépéssel történt (2x 2500 x g), majd az EVket méretkizárásos kromatográfiával izoláltuk. Az nCS1 MRPS készülékkel (Spectradyne LLC, USA) történő részecskeszám meghatározás a 65 nm – 250 nm és 250 nm – 2000 nm közötti mérettartományban történt. A Flu-SEC mérések egy FP-2020 fluoreszcenciás detektorral összekapcsolt HPLC rendszerrel (Jasco, Japan) történtek egy 4 mL CL-2B géllel töltött méretkizárásos oszlop használatával. A EV minták fluoreszcens jelöléséhez PE-CD61, PE-CD81 és AF488-CD41 antitesteket használtunk.

Az MRPS mérések alapján a szérumban jelentősen magasabb EV koncentráció volt tapasztalható (1010 illetve 7x107 részecske/mL) mint a plazmában (4-6x109 illetve 1-2x107 részecske/mL). A két technika kombinációjával a vérlemezke és az extracelluláris vezikula specifikus fluoreszcens antitestekkel jelölt EVk mértékét is meg tudtuk határozni.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást az NKFIH PD 121326 és NVKP_16-1-2016-0007 pályázatok anyagi támogatásával végeztük. V.Z. munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatta.

Fekete Tamás
Measuring binding force between glutathione-functionalized microtools and blood brain barrier cells with optical tweezer

P48

Measuring binding force between glutathione-functionalized microtools and blood brain barrier cells with optical tweezer

Tamás Fekete, Mária Mészáros, Gergő Porkoláb, Szilvia Veszelka, Mária Deli, Lóránd Kelemen

Institute of Biophysics, Biological Research Centre of the Hungarian Academy of Sciences, Temesvári krt. 62, H-6726 Szeged, Hungary

In this work functionalized and optically actuated microstructures are used to study the adhesion between cell membrane-associated proteins and their ligands. Literature indicates that such proteins from the solute carrier transporter family can be effectively used in the active transport of drugs to the brain through cells forming the blood brain barrier (BBB). Mészáros and co-workers found if transporter protein ligands, such as alanine, D-glucose or glutathione are mounted on the surface of niosomes encapsulating the drug to be delivered, the uptake rate into the BBB cells increases (Mészáros et al. 2018). In this study we characterize ligand binding by measuring the force between these ligands, immobilized covalently on the optically actuated microstructures and the BBB’s component cells. The complex-shaped microstructures (Aekbote et al 2016) were made by two-photon polymerization and equipped with a flat end of variable surface area that interacts with the cell membrane. The ligand-coated structures are pressed against the cells, grown on a vertical support, and when retracted, the rupture force is measured. Since optical tweezers can exert lower forces that an AFM cantilever, these experiments can elucidate finer interactions responsible for the ligand binding to the BBB cells surface.

References

Mészáros M, Porkoláb G, Kiss L et al. Niosomes decorated with dual ligands targeting brain endothelial transporters increase cargo penetration across the blood-brain barrier, Eur J Pharm Sci, 123:228–240, 2018, doi.org/10.1016/j.ejps.2018.07.042

Aekbote BL, Fekete T, Jacak J, Vizsnyiczai G, Ormos P, and Kelemen L, Surface-modified complex SU-8 microstructures for indirect optical manipulation of single cells, Biomed Optics Express, 7:45-56, 2016, doi.org/10.1364/BOE.7.000045

Cs. Szabó Bence
A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

P47

A sejtmembrán szterol tartalmának változtatása módosítja a Kv1.3 ioncsatorna lipidtutajok és egyéb membrán mikrodomének közötti megoszlását

Cs. Szabó Bence, Szabó Máté, Zákány Florina, Varga Zoltán, Nagy Péter, Kovács Tamás

Debreceni Egyetem ÁOK Biofizikai és Sejtbiológia Intézet

A limfociták aktivációjában szerepet játszó Kv1.3 ioncsatornáról ismert, hogy preferenciálisan a lipidtutajokban helyezkedik el. A lipidtutajokban található jelátviteli környezet szerepet tölthet be az ioncsatorna működésének szabályozásában. Munkacsoportunkban korábban kimutatták, hogy a membrán szterol tartalmának szelektív növelése megváltoztatja a Kv1.3 elektrofiziológiai jellemzőit. A töltések során bevitt szterolok és a csatorna kölcsönhatásának pontos mechanizmusa azonban nem ismert.

Célunk volt a membrán szterol tartalmának szelektív manipulálása után a Kv1.3 és a lipidtutajok közötti kolokalizáció vizsgálata. Ehhez HEK-293 sejtekben a koleszterin vagy 7-dehidrokoleszterin (7DHC) mennyiségét növeltük a megfelelő szterol/metil-béta-ciklodextrin (MBCD) komplexekkel, illetve koleszterint vontunk ki a sejtek membránjából MBCD alkalmazásával. Ezután jelöltük a sejtekbe transzfektált Kv1.3-FLAG csatornákat anti-FLAG antitesttel és a lipidtutajokat koleratoxin B alegységével, majd konfokális, illetve stimulált emisszió kioltás (STED) mikroszkóp segítségével felvételeket készítettünk. Kvantitatív képanalízis során meghatároztuk a Kv1.3, illetve tutaj jelölők intenzitásai közötti Pearson-féle korrelációs koefficiens értékét.

Méréseink alapján a kontrollhoz (0,416±0,013, n=27) képest a membrán koleszterin, illetve 7DHC tartalma növelésének hatására a Kv1.3 tutajokkal történő kolokalizációja szignifikánsan (p<0,05) növekedett (koleszterin esetén 0,492±0,013, n=34; 7DHC mellett 0,500±0,015, n=32), míg MBCD kezelés után szignifikánsan csökkent (0,338±0,014, n=30). Konfokális mikroszkópos eredményeinket a nagyobb feloldóképességgel bíró STED mikroszkópiával is megerősítettük (kontroll: 0,274±0,025, n=25; koleszterin: 0,361±0,019, n=32; 7DHC: 0,366±0,019, n=28; MBCD: 0,219±0,022, n=24).

Kísérleteink során kimutattuk, hogy a Kv1.3 membrán mikrodomének közötti megoszlása függ a sejtmembrán szterol tartalmától, ami mediálhatja a szterolok ioncsatornákra kifejtett hatásait.

Bodor Zsanett
Lactobacillus bulgaricus növekedésének követése joghurtban elektromos impedanciával

P46

Lactobacillus bulgaricus növekedésének követése joghurtban elektromos impedanciával 

Bodor Zsanett1, Zaukuu John-Lewis Zinia1, Kaszab Tímea1, Lambert-Meretei Anikó1, Rashed Mahmoud S.1, Kovács Zoltán1, Mohácsi-Farkas Csilla2 és Vozáry Eszter1

1 Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar, Fizika-Automatika Tanszék

2 Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar, Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék

A joghurt tejből készül tejsavas erjedéssel a tejsav baktériumok, pl. a Lactobacillus Bulgaricus közreműködésével. Számos faja ismert, amelyeknek különböző a fermentációs aktivitása és a szaporodó képessége. Egyre nagyobb az igény az egyes fajok pontos ismeretére, mivel élettani szempontból jelentősek. A klasszikus sejtszámlálási módszer nagyon időigényes és képzett szakembert kíván. Gyors módszerre van szükség a baktériumok szaporodás követésére. Az elektromos impedancia spektroszkópia alkalmas lehet a kémiai környezetváltozás és a baktérium szám növekedés követésére. Jelen munkákban a tejsav baktériumok szaporodásának követésére a joghurt elektromos impedancia paramétereinek a változását használtuk.

A Lactobacillus Bulgaricus néhány faját használtuk joghurt készítésére. Ultra-magas hőmérsékleten kezelt (UHT) 1,5 % zsírtartalmú tejet oltottunk be a tejsav baktériumokkal. A sejt számot MRS (De Man, Rogosa and Sharpe) agaron öntés technológiával határoztuk meg 12 órán keresztül óránként 37 °C hőmérsékleten. Az elektromos admittancia valós (vezetés) és képzetes (szuszceptancia) részét mértük 12 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 50 Hz – 800 kHz frekvencia tartományban egy HP4384A precíziós LCR mérővel. A baktérium sejt szám 103 –ról 107-re (CFU/ml) nőtt. A baktériumszám növekedése és a szuszceptancia növekedése közötti összefüggésre készített regressziós modell jól írja le a sejtszám növekedést. A pontos kísérleti módszer kidolgozásával a szuszceptancia alkalmas lehet a baktérium szaporodás követésére.

Köszönetnyilvánítás

A Szent István Egyetem Élelmiszer tudományi Doktori Iskolája, az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00005 Európai Alapítvány és az MTA Bolyai ösztöndíj támogatta ezt a munkát

Barkó Szilvia
Phalloidin as a bacterial actin-labeling agent

P45

Phalloidin as a bacterial actin-labeling agent 

Szilvia Barkó1,5, Beáta Longauer1, Emőke Bódis1, Dávid Szatmári1, Zoltán Ujfalusi1, Robert C. Robinson2,3 and Miklós Nyitrai1,4,5

1Department of Biophysics, Medical School, University of Pécs, Szigeti str. 12, Pécs, H-7624, Hungary

2Research Institute for Interdisciplinary Science, Okayama University, Okayama 700-8530, Japan.

3VISTEC, Thailand

4MTA-PTE Nuclear-Mitochondrial Interactions Research Group, Szigeti str. 12, Pécs, H-7624, Hungary

5Szentágothai Research Center, University of Pécs, Hungary

The visualization of subcellular objects by microscopy is one of the most important tools in biological studies. Some subcellular objects, due to their smallness in size, can challenge the physical barrier of resolution for microscopy. Although this area of biophysics is rapidly evolving limitations remain. The internal organization of eukaryotic cells is becoming better characterized due to the wealth of visualization probes that are available. Prokaryotes are smaller and their internal cellular organization has been resolved to a lesser extent. One recent study highlights one problem that there are only very few optical compounds that can be applied to visualize components of bacterial cells. The visualization of cytoskeletal components has a long history. For example, eukaryotic actin F-actin has been visualized in many studies by fluorescently conjugated phalloidin. This peptide is a toxin from the mushroom Amanita phalloides, which specifically binds to F-actin. However, in order to visualize F-actin in vivo, the cell membrane must be permeabilized because phalloidin is a membrane-impenetrable compound consequently it cannot enter the cell.

Two decades ago, phalloidin was reported to bind to bacterial actin-like proteins. At that time, microscopy technology had not developed sufficiently to solve the fine structure of the fluorescently-labelled cytoskeleton organization, and only low resolution images were obtained. Here, we used fluorescently-conjugated phalloidin to visualize MreB in vitro, and determine the in vivo localization of MreB in Gram positive and Gram negative cells. We tested the effects of phalloidin on the dynamics of MreB and on the viability of bacterial cells. By contrast to the harmful effects of phalloidin on actin dynamics and eukaryotic cell viability, phalloidin did not affect MreB dynamics of bacterial growth rates, however it did induce a morphology change to longer cell chain lengths.

Acknowledgement

OTKA-107776: An anchor biological systems characteristics: the structural and functional properties of bacterial filaments.

Ábrahám Ágnes
Baktériumok fenotípusbeli variabilitásának vizsgálata mikrofluidikai sejtcsapdákkal

P44

Baktériumok fenotípusbeli variabilitásának vizsgálata mikrofluidikai sejtcsapdákkal

Ábrahám Ágnes1, Nagy Krisztina1, Csákvári Eszter1, Dér László1 és Galajda Péter1

1 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

Változó környezetben a sejtek közti fenotípusbeli és viselkedésbeli különbségek kulcsszerepet játszanak a sejtek túlélésében, a környzethez való alkalmazkodásukban, illetve a baktérium populációk evolúciójában.

Ennélfogva az egysejt szintű megfigyelések alapvető fontosságúak a baktérium populációk fejlődésének és működésének megértéséhez.

Jelenleg egy olyan mikrofluidikai eszköz kifejlesztésén dolgozunk, amely mikrofluidikai egysejt csapdák sorozatából áll. Ezzel az eszközzel vizsgálni tudjuk a quorum sensig folyamat során kialakuló sejt-sejt változatosságot, a növekedés- és osztódásbeli különbségeket, továbbá a környezeti stresszhatásokra adott válaszreakciókat.

Egy módosított „mother machine” eszközzel képesek vagyunk egyetlen sejt utódsejtjeinek csapdázására és megfigyelésére több generáción keresztül. Ez lehetővé teszi számunkra a sejtek közti variabilitás vizsgálatát, illetve úgy véljük, többet megtudhatunk arról, hogy a fenotípus- és viselkedésbeli variabilitás hogyan függ össze a leszarmazási viszonyokkal és a sejtöregdéssel.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás az NKFIH K 116516 és PD 124889 kutatási pályázatai, illetve a GINOP-2.3.2-15-2016-00001, a GINOP-2.3.2-15-2016-00026 és a GINOP-2.3.2-15-2016-00037 pályázatok támogatásával valósult meg.

Tibély Gergely
Szubklonális szerkezet tumorokban

P43

Szubklonális szerkezet tumorokban

Tibély Gergely1,2, Szöllősi Gergely1,2 és Derényi Imre1,3

1 ELTE Biológiai Fizika Tanszék

2 MTA-ELTE Evolúciós Genomika kutatócsoport

3 MTA-ELTE Statisztikus és Biológiai Fizika kutatócsoport

A tumoron belüli heterogenitás a tumorsejtek osztódása során bekövetkező tökéletlen DNS másolás következtében jelenik meg, egy szomatikus evolúciós folyamathoz vezetve. Az utóbbi években megjelent kutatások alapján a szubklonális mutációk száma jóval nagyobbnak tűnik, mint ami a humán szomatikus mutáció ráta ismert becslései alapján várható, neutrális mutációkat feltételezve [1,2]. Feltételezhető, hogy a magas mutációszámot vagy egy, az irodalminál szignifikánsan magasabb mutációs ráta okozza, vagy gyakori sejthalál, amely a sejtek leszármazását sok generációval hosszabbá teszi, ezáltal minden sejt több osztódáson megy keresztül.

A bemutatott kutatás keretében eszközöket fejlesztünk különböző mutációs ráta-halálozási ráta paraméterértékekkel rendelkező generatív modellek valószínűségének becslésére. A modell a szekvenálási hibákat is képes figyelembe venni, amelyek a gyakorlatban az empirikus adatok mutáns readjeit dominálják. A teszteredmények alapján a valós paraméterértékek visszanyerhetőek, a sejthalál és a mutációs ráta hatásai szeparálhatóak.

Irodalom

[1] Williams M J, Werner B, Barnes C P, Graham T A, Sottoriva A. Identification of neutral tumor evolution across cancer types. Nat Genet 2016; 48:238-244.

[2] Martincorena I, Campbell P J. Somatic mutation in cancer and normal cells. Science 2015; 349:1483-1489.

Szöllősi Gergely
Hierarchical tissues that minimize somatic evolution

P42

Hierarchical tissues that minimize somatic evolution

Demeter Márton 2 , Grajzel Dániel 2 , Derényi Imre 1 , Szöllősi Gergely 1,2

1 Biológiai Fizika Tanszék, ELTE

2 MTA-ELTE “Lendület” Evolúciós Genomika Kcs.

Cancer development is a somatic evolutionary process where cells must divide and as a result mutations that can ultimately lead to neoplastic progression may accumulate. Hierarchically organized tissues can slow down somatic evolution by reducing the number of cell divisions along cell lineages thus limiting mutation accumulation [1] and by ”washing out” mutations even if they confer a proliferative advantage [2].

Here we explore the structure of hierarchical tissues that minimize somatic evolution. We derive the critical number of mutations, necessary for triggering neoplastic progression as a function of dynamical parameters of the hierarchy. Using this results we are able to analytically estimate the probability of neoplastic progression based on statistical characteristics of the cell-linage tree. We find a trade off between mutation accumulation and the proliferative disadvantage of cells in the hierarchy leading to an evolutionary optimum in the probability of neoplastic progression.

In particular we find that in tissues with physiologically realistic parameters the division rate of stem cells is higher than the extremely low rates required to minimize mutation accumulation [1]. The resulting optimum induced by selection is characterized by a relatively large number of stem cell divisions, with the consequence that the majority of the driver mutations can accumulate within stem cells.

References:

[1] Derenyi & Szollosi, Hierarchical tissue organization as a general mechanism to limit the accumulation of somatic mutations.

Nature Communications 2017

[2] Nowak, Michor, Isawa, The linear process of somatic evolution. PNAS 2003

Péret Jiménez Mario
The hierarchical structure of the hematopoietic system can explain chronic myeloid leukaemia progression.

P41

The hierarchical structure of the hematopoietic system can explain chronic myeloid leukaemia progression.

Pérez Jiménez Mario1, Derényi Imre2 and Szöllősi Gergely3

1 Eötvös Loránd University, Department of Biological Physics

2 Department of Biological Physics, ELTE-MTA ‘Lendulet’ Biophysics Research Group

3 Department of Biological Physics, ELTE-MTA ‘Lendulet’ Evolutionary Genomics.

Chronic myeloid leukaemia (CML) is one of the most studied and well-known cancer types. It was the first known human cancer that can be initiated by a single chromosomal abnormality, this translocation is known as the BCR-ABL1 fusion gene [1]. CML progression is divided into three phases, these can be distinguished with a bone marrow biopsy or a blood smear test. These two methods provide clear criteria for each one of the stages [2].

The initial chronic phase is characterized by a long constant evolution estimated between 5 and 7 years. This initial phase is defined by an increased number of white blood cells (WBC) and the limited presence of immature blasts cells in the blood. Despite the presence of blast cells in the blood, the full spectrum of mature cells is still present. At this point, a cytogenetic analysis will conclude that BCR-ABL1 mutated cells have replaced healthy cells.

Transition to more advanced stages of the disease is characterized by an increased amount of blast cells in the blood (above 20%). Mature cells cannot be found in blood samples anymore. Tumour heterogeneity is also common in advanced phases. Resistance to treatment and unresponsive high WBC count are stereotypic of the final stage of the disease.

A model of hierarchical differentiation [3] is used to simulate the hematopoietic system in silico. We perform simulations about the dynamics of the BCR-ABL1 mutants in a two-compartment system. Terminally differentiated cells can migrate from the bone marrow to the bloodstream in healthy conditions. The chronic phase is in agreement with increased cellularity in the bone marrow and the initial leaking of progenitor cells to the bloodstream. In the simulation, new mutations increase self-renewal and stop the differentiation capacity of cells.

Our results show that CML development can be explained based on the hierarchical structure of blood formation. The model provides a mathematical picture of CML progression, while the simulations provide with a quantitative and accurate description. Our results provide insight about cancer dynamics, from the initial mutation to final irreversible cell growth.

References

[1] Provan, Drew & Gribben, John. (2018). Molecular hematology.

[2] Junia V. Melo & David J. Barnes. Nature Reviews Cancer ,7 441453 (2007).

[3] Derényi Imre & Szöllősi Gergely J. Nature Communications, 8 14545 (2017).

Grajzer Dániel
In hierarchical tissues small compartments lead to a selective threshold below which mutations cannot persist

P40

In hierarchical tissues small compartments lead to a selective threshold below which mutations cannot persist

Grajzel Dániel1,3, Derényi Imre1,2 és Szöllősi Gergely1,3

1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Fizika Intézet

2 MTA-ELTE Statisztikus és Biológiai Fizika Kutatócsoport

3 MTA-ELTE Lendület Evolúciós Genomika Kutatócsoport

Cancer is a genetic disease fuelled by somatic evolution. Hierarchical tissue organisation can slow somatic evolution by two qualitatively different mechanisms: by cell differentiation along the hierarchy ‘‘washing out’’ harmful mutations [1][2](Nowak 2003, Werner 2013) and by limiting the number of cell divisions required to maintain a tissue [3] (Derényi and Szöllősi 2017). Here we explore the effects of differences in compartment size on somatic evolution in hierarchical tissues by considering cell number regulation that acts on cell division rates such that the number of cells in the tissue has the tendency to return to its desired homeostatic value.

Introducing mutants with a proliferative advantage we demonstrate the existence of a third fundamental mechanism by which hierarchically organised tissues are able to slow down somatic evolution. We show that tissue size regulation in hierarchically organized tissues leads to the emergence of a threshold proliferative advantage, below which mutants cannot persist. We find that the most significant determinant of the threshold selective advantage is compartment size, with the threshold being higher the smaller the number of cells in the compartment.

Our results demonstrate that in sufficiently small compartments even mutations that confer substantial proliferative advantage cannot persist, but are expeled from the tissue by differentiation along the hierarchy. The resulting selective barrier can significantly slow down somatic evolution and reduce the risk of cancer by limiting the accumulation of mutations that increase the proliferation of cells.

Irodalom

[1] Nowak M, Michor F, Iwasa Y (2003) The linear process of somatic evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences 100:14966-14969.

[2] Werner B, Dingli D, Traulsen A (2013) A deterministic model for the occurrence and dynamics of multiple mutations in hierarchically organized tissues. Journal of The Royal Society Interface 10:20130349-20130349.

[3] Derényi I, Szöllősi G (2017) Hierarchical tissue organization as a general mechanism to limit the accumulation of somatic mutations. Nature Communications 8:14545.

Demeter Márton Csaba
The structure of hierarchical tissues that minimize somatic evolution

P39

The structure of hierarchical tissues that minimize somatic evolution 

Demeter Márton Csaba1, Derényi Imre2 és Szöllősi Gergely3

1,2,3 ELTE-MTA „Lendület” Evolúciós Genomika kutatócsoport

Self-renewing tissues of multicellular organisms produce cells using hierarhical differentaion. Such hierarhically organised tissues surpress somatic evolution and thus delay aging and the emergence of tumours at two levels of the evolutaionry process. At the level of selection, even mutations that provide a proliferative advantage can be "washed out" as a result of differntiaion [2], while at the level of mutation accumulation hierarhical organizagtion can limit the number of cell divisions, and as a result the mutaional burden of maintaining tissues [1].

Here we explore the structure of hierarchical tissues that minimize somatic evolution. We introduce a generic quantity, the self-renewal potential, which quantifies the ability of cells to avoid being "washed out" and determines their fitness at a hierarchical level. Using the self-renewal potential, which in healthy tissue is negative for non stem cells, the critical number of mutations, necessary for triggering neoplastic progression at a certain hierarchical level can be obtained. We are able to analytically estimate the probability of neoplastic progression in hierarhical tissues using the theory of birth death processes and the statistical characteristics of the cell-linage tree. We find that in general there is a trade off between mutation accumulation and the proliferative disadvantage of cells in the hierarchy leading to an evolutionary optimum in the probability of neoplastic progression.

In particular we find that in tissues with physiologically realistic parameters the division rate of stem cell is higher than the extremely low rates required to minimize mutation accumulation alone. The resulting optimum induced by selection is characterized by a relatively large number of stem cell divisions, with the consequence that the majority of the driver mutations can accumulate within stem cells.

Irodalom

[1] Hierarchical tissue organization as a general mechanism to limit the accumulation of somatic mutations, Imre Derenyi, Gergely J Szollosi Nature Communications volume 8, Article number: 14545 (2017) https://doi.org/10.1038/ncomms14545

[2] Nowak, Michor, Isawa, The linear process of somatic evolution. PNAS 2003

Sipka Gábor
Fény által kiváltott konformáció-változások jellemzése és azok dinamikájának feltárása Thermosynechococcus vulcanus PSII komplexben

P38

Fény által kiváltott konformáció-változások jellemzése és azok dinamikájának feltárása Thermosynechococcus vulcanus PSII komplexben

Sipka Gábor1*, Stefano Santabarbara2, Pavel Müller3, Klaus Brettel3, Magyar Melinda1, Qingjun Zhu4, Yanan Xiao4, Guangye Han4, Petar H. Lambrev1, Jian-Ren Shen4,5, Garab Győző1,6

1Biological Research Centre, Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Hungary

2Photosynthetic Research Unit, National Research Council of Italy, Milano, Italy

3Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Univ. Paris-Sud, Université Paris-Saclay, Gif-sur-Yvette, France.

4Photosynthesis Research Center, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

5Photosynthesis Research Center, Okayama University, Okayama, Japan

6Faculty of Science, University of Ostrava, Ostrava 1, Czech Republic

A második fotokémiai rendszernek (PSII) kiemelkedő szerepe van a fotoszintézis folyamatában, hiszen egyedül ez a szuperkomplex képes a víz bontására, és így a légköri oxigén termelésére. Korábban, DCMU-kezelt PSII reakciócentrum-core komplexek (RC-CC) STSF-indukált változó klorofill-a fluoreszcencia (Fv) kinetikájának vizsgálatával azonosítottunk egy sebességkorlátozó lépés-sort [1] (STSF, egyszeres telítési-gerjesztő fényimpulzus): megállapítottuk, hogy – az irodalomban legáltalánosabban elfogadott modellel ellentétben – a primér kinon akceptor (QA) redukciója (egyetlen STSF-el) nem emeli a minimális Fo szintről a maximális Fm értékre, hanem csak egy Fo+Pheo tranziensek generálhatók [2]. Mélyhőmérsékleten (80 – 120 K) végzett fluoreszcencia emissziós tranziens spektroszkópiai mérésink azt mutatták, hogy az Fo-F1 és az F1-Fm tranziens állapotokhoz, azaz a QA-QA-hoz és a töltésszétválasztott-fényadaptált állapotokhoz, más-más spektrumok társíthatók. A különbségeket főként a 685 nm-es emissziós sávon figyeltük meg minden kriogén hőmérsékleten, ahol a két emissziós sáv, az F685 és az F695, feloldható. A megfigyelt változásokat okozhatja a QA erős helyi elektromos mezőjére szuperponált P680+Pheo erős lokális tranziens tere és/vagy egy, a töltésrekombinációt követő, termális tranziens. Ezek módosíthatják a RC-CC dielektrikum szerkezetét / konformációs állapotát és így az energiatranszfer Shibata és mtsai [3] által korábban feltárt útvonalait. Mélyhőmérsékeleten ezek az addicionális konformációs állapotváltozások tehetők felelőssé az Fv(=Fm-Fo) emelkedés legnagyobb hányadáért (80 K-n ~90%-áért). Eredményeink azt mutatják, hogy PSII két állapota, a nyitott (sötét-adaptált) és zárt (stabil töltésszétválasztást követő) állapotai mellett számolnunk kell annak fényadaptált állapotával is, amely a stabil-töltésszétválasztást követően, megvilágítás hatására alakul ki. Ennek fiziológiai jelentősége még nem ismert.

Irodalom

[1] M. Magyar, G. Sipka, L. Kovacs, B. Ughy, Q.J. Zhu, G.Y. Han, V. Spunda, P.H. Lambrev, J.R. Shen, G. Garab (2018) Rate-limiting steps in the dark-to-light transition of Photosystem II - revealed by chlorophyll-a fluorescence induction, Scientific Reports, 8.

[2] G. Sipka, P. Muller, K. Brettel, M. Magyar, L. Kovacs, Q. Zhu, Y. Xiao, G. Han, P.H. Lambrev, J.R. Shen, G. Garab (2019) Redox transients of P680 associated with the incremental chlorophyll-a fluorescence yield rises elicited by a series of saturating flashes in diuron-treated photosystem II core complex of Thermosynechococcus vulcanus, Physiol Plant, 166:22-32.

[3] Y. Shibata, S. Nishi, K. Kawakami, J.R. Shen, T. Renger (2013) Photosystem II does not possess a simple excitation energy funnel: time-resolved fluorescence spectroscopy meets theory, J Am Chem Soc, 135:6903-6914.

Pirisi Katalin
OaPAC fehérjén végzett vizsgálatok TA spektroszkópia segítségével

P37

OaPAC fehérjén végzett vizsgálatok TA spektroszkópia segítségével

Pirisi Katalin, Yin Li, Sofia Kapetanaki, Lukács András

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai Intézet

A cAMP másodlagos hírvivő molekulaként fontos szerepet játszik a sejten belüli jelátviteli folyamatokban. Részt vesz például a glükagon és adrenalin hormonok hatásának kiváltásában. A jelátviteli molekulát a BLUF domént tartalmazó OaPAC fehérje termeli kék fény hatására.

A BLUF domén fehérjék a fényérzékeny flavoproteinek egy fontos családját alkotják, amelyekben a fotoaktiváció során strukturális átrendeződés megy végbe. BLUF domén található például az Euglena gracilis ostoros egysejtűben, illetve a jól ismert Rhodobacter Sphaeroides, vagy az Oscillatoria Acuminata baktériumban is.

Jelen munkában ez utóbbi baktériumból származó OaPAC (Oscillatoria Acuminata, fotoaktivált adenilát cikláz) nevű fehérjén (és így az általa termelt cAMP-n) végeztünk vizsgálatokat tranziens abszorpciós spektroszkópia segítségével.

Méréseink eredményeként kapott kinetikák az OaPAC egy gyors, néhány pikoszekundumos és egy hosszabb (szintén pikoszekundumokban mérhető) relaxációját feltételezik, a jelenlévő két különböző állapotnak megfelelően.

Irodalom

Structural insight into photoactivation of an adenylate cyclase from a photosynthetic cyanobacterium, Mio Ohki et al. PNAS 2016

EFOP-3.6.2-16-2017-00005


Parveen Akhtar
Temperature-dependent energy transfer in LHCII probed by 2D electronic spectroscopy

P36

Temperature-dependent energy transfer in LHCII probed by 2D electronic spectroscopy

Parveen Akhtar1,2, Thanh Nhut Do3, Adriana Huerta-Viga3, Pawel Nowakowski3, Howe-Siang Tan3, Petar H. Lambrev1

1 Biological Research Centre HAS, Plant Biology Institute

2 ELI-ALPS, ELI Nonprofit Ltd.

3 Nanyang Technological University, School of Physical and Mathematical Sciences, Singapore

The efficiency of photosynthetic light energy conversion depends on the ability of the photosynthetic apparatus to harvest the solar energy and transfer to the photochemical reaction centres without losses. Excitonic interactions between chlorophylls in LHCII, the main light-harvesting antenna of Photosystem II, provide a way for fast and efficient directional excitation energy transfer (EET) in a less than 100 femtoseconds to picoseconds. Despite the wealth of data about the kinetics of EET, the presently existing models report different kinetics of EET in LHCII. Two-dimensional electronic spectroscopy (2DES) is a powerful technique for mapping EET pathways. We studied EET in LHCII by 2DES at various temperatures from 77 K to 293 K under conditions free from singlet-singlet annihilation. Global lifetime analysis revealed that spectral equilibration occurs over distinct timescales – from < 200 fs to 5 ps at 293 K, as previously published [1]. However, slower timescales are observed at lower temperatures – up to tens of picoseconds at 77 K. A clear temperature dependence of uphill energy transfer processes is also discerned, which follows the detailed-balance condition. We applied phenomenological model fitting to resolve exciton states and microscopic rates of energy transfer. The experimental and modeling results at 77 K are generally in good agreement with existing exciton models of LHCII, but specific differences especially in the slow picosecond relaxation kinetics suggest the need for model refinement. Protein motions substantially improve the efficiency of light harvesting at physiological temperature.

Acknowledgements

The work was supported by grants from the Singapore Ministry of Education Academic Research Fund (Tier 2 MOE2015-T2-039), the Hungarian Ministry of Finance (GINOP-2.3.2-15-2016-00001), and the National Research, Development and Innovation Office (NKFIH NN 124904; 2018-1.2.1-NKP-2018-00009). The ELI-ALPS project (GINOP-2.3.6-15-2015-00001) is supported by the European Union and co-financed by the European Regional Development Fund.

References

[1] Akhtar P, Zhang C, et al (2017) J Phys Chem Lett 8: 257–263

Lingvay Mónika
A fotoszintézis inaktiválása az antenna szintjén: az LHCII érzékenysége közvetlen fotokárosodásra

P35

A fotoszintézis inaktiválása az antenna szintjén: az LHCII érzékenysége közvetlen fotokárosodásra

Lingvay Mónika1,2, Akhtar Parveen1,3, Sebőkné Nagy Krisztina4, Páli Tibor4 és Lambrev Petar1

1 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Növénybiológiai Intézet

2 Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és Informatikai Kar, Fizika Doktori Iskola

3 ELI-ALPS, ELI Nonprofit Kft.

4 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

A fotoszintetikus apparátus egyik kulcsfontosságú jellemzője a fénykárosodással szembeni ellenállóképessége és aktív védelme, mely funkciók a teljes rendszer összehangolt működését feltételezik. Ismeretes, hogy a II. fotokémiai rendszer magas fényintezitás mellett hajlamos fénygátlásra / fotoinhibícióra, de még vitatott, hogy a II. fénybegyűjtő komplex (LHCII) lehet-e célpontja elsődleges fénykárosodásnak. A fénykárosodás egyik lehetséges mechanizmusa a triplett gerjesztett állapotú klorofillok (Chl) keletkezése, amelyek kölcsönhatásba lépve az oxigénnel, szingulett oxigént és más reaktív oxigén formákat képezhetnek; habár ismeretes, hogy az LHCII-ben kötött karotinoidok hatékonyan kioltják a triplett állapotokat.

A kutatás célja izolált LHCII fénykárosodásra való hajlamának, ennek a molekuláris környezettől való függésének és a fizikai mechanizmusainak tanulmányozása. Ennek érdekében, borsó tilakoidmembránokból tisztított LHCII-t fehérje-aggregátumokként szuszpendáltuk, detergens micellákban szolubilizáltuk, illetve különböző lipidösszetételű rekonstituált membránokba ágyaztuk. A nagy fényintenzitás hatásait ezen in vitro modellekre biofizikai és biokémiai vizsgálatokkal elemeztük.

Eredményeink azt mutatták, hogy az LHCII in vitro sugárzással szembeni ellenállóképessége erősen környezetfüggő, és hogy az LHCII jobban kitett a fény káros hatásának lipid-környezetben. Kimutattuk, hogy a fotokárosodás oxigén-függő, és különböző antioxidánsok fotoprotektív hatását is bizonyítottuk. A malondialdehid–tiobarbitursav reaktivitási teszt kimutatta, hogy a megvilágítás a membránlipidek LHCII által közvetített peroxidációját eredményezi. A szingulett oxigén képződését és kölcsönhatásait a fény által kitett LHCII környezetekben kvantitatívan vizsgáltuk az elektronspin-rezonancia spektroszkópia módszerével, spincsapdák és -jelölők segítségével.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás a Nemzetgazdasági Minisztérium GINOP-2.3.2-15-2016-00001 pályázatának és az Emberi Erőforrások Minisztériuma ÚNKP-17-3-I kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának támogatásával valamint a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Alap (NKFIA) K 112716 pályázatának részleges támogatásával készült.

Szabó Tibor
Fotoszintetikus reakciócentrum fehérje alapú valós idejű bioszenzor

P34

Fotoszintetikus reakciócentrum fehérje alapú valós idejű bioszenzor

Szabó Tibor1,2, Csekő Richárd2, Égerházi László2, Szabó Anna3, Janovics Róbert1, Túri Marianna1, Futó István1, Rinyu László1, Hernádi Klára3 és Nagy László2

1 MTA Atommag kutató intézet, Hertelendi Ede Környezetanalitikai Laboratórium

2 Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Fizikai és Orvosi Informatikai Intézet

3 Szegedi Tudományegyetem, Alkalmazott és Környezeti kémiai Tanszék

Különböző dimenziójú szén alapú nanoanyagok állíthatók elő (1-3D, csövek, kötegek, filmek, szivacsok, grafén lapok), melyek elkészítési módja és tulajdonságaik az irodalomban széles körben tárgyaltak. Egyedülálló tulajdonágaiknak köszönhetően, ezek az anyagok igen ígéretesnek bizonyultak nemcsak laboratóriumi körülmények között, de akár iparban történő alkalmazásra is. A fehérje alapú bio-nanoanyagok, melyeket a „jövő anyagainak” tekintenek, forradalmi változást hozhatnak az integrált optika (pl.:optikai kapcsolók, mikroképalkotási rendszerek, szenzorok, telekommunikációs technológiák, energiatermelés) területén.

Munkánk során számos szén alapú hordozó anyagot állítottunk elő, melyek között voltak tisztán szén alapú és egyéb atomokkal (nitrogén, kén) adalékolt anyagok is. Mindemellett teszteltük a különböző fém katalizátorok hatását a CVD szintézissel előállított szén nanocsövek tulajdonságaira. A beépült heteroatomok mennyiségét radiokémiai és izotópanalitikai módszerek segítségével határoztuk meg, ezt követően összevetettük a kapott anyagok fizikai és kémiai tulajdonságait. A heteroatomok szerkezetre gyakorolt hatását elektronmikroszkópiás eljárásokkal vizsgáltuk.

Az előállított hordozó anyagaink felhasználásával fehérje alapú bio-nanokompozitokat hoztunk létre. C14 tartalom meghatározásával megállapítottuk a fehérje (fotoszintetikus membránban elhelyezkedő reakciócentrum fehérje (RC)) arányát a kompozitban, így annak ismeretében az abszolút enzimaktivitás is kiszámítható.

A kialakított kompozit anyagok bioszenzorként alkalmazhatóak, herbicidek kimutatására és koncentrációjuk meghatározására alkalmasak. Ennek érdekében egy mikrofluidikai cellát terveztünk és készítettünk el 3D nyomtatásos technológia segítségével, mellyel áramlásos körülmények között valós idejű mérésekre van lehetőség.

A munka a GINOP-2.3.2.-15-2016-00009 ‘IKER’ projekt támogatásával készült.


Petrovszki Dániel
E. coli sejtek dielektroforetikusan erősített detektálása integrált optikai bioszenzorral

P33

E. coli sejtek dielektroforetikusan erősített detektálása integrált optikai bioszenzorral 

Petrovszki Dániel1, Valkai Sándor1, Gora Evelin1, Tanner Martin1, Bányai Anita2, Fürjes Péter2 és Dér András1

1 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

2 MTA Energiatudományi Kutatóközpont, Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézet

Manapság az orvosi diagnosztikában egyre nagyobb teret kap a bioszenzorok alkalmazása. Ezen érzékelők legérzékenyebb konstrukciói általában valamilyen (pl. fluoreszcens) jelöléstechnikán alapulnak, ami megnöveli az eszközök költségét és válaszidejét. Napjainkban ezért fejlődésnek indult a gyorsabb, olcsóbb, jelölésmentes technikák alkalmazása is, különösen a betegágy melletti diagnosztikában. Az optikai elven működő rendszereket e kategórián belül is a legígéretesebbek közé sorolják. Kutatásaink során egy integrált optikai érzékelő rendszert alkottunk meg baktériumsejtek jelölésmentes detektálására. A létrehozott konstrukcióban a mikrofluidikai csatornában elhelyezkedő hullámvezető struktúra környezetébe dielektroforetikus gyűjtésre alkalmas felszíni elektródarendszert [1] helyeztünk el annak érdekében, hogy minél nagyobb számú célobjektumot detektálhassunk. Az érzékelő eszköz hatékonyságának teszteléséhez kvantitatív vizsgálatokat végeztünk a hullámvezető környezetében elhelyezkedő E. coli baktériumsejteken a hullámvezetőből kiszóródott fény detektálásával. Ezzel az új rendszerrel 〖10〗^4 CFU/ml nagyságrendű kimutatási határt értünk el, amely összemérhető a vizeletben található jellemző patogén-koncentrációval. Terveink közt szerepel a dielektroforetikus sejtgyűjtő módszernek az alkalmazása más, érzékenyebb integrált optikai szenzor konstrukciókban is, létrehozva egy betegágy melletti diagnosztikában is alkalmazható eszközt.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük a téma kutatása során nyújtott segítségét Borbíró Andrásnak, Varga Máténak, Kunstár Károlynak, Charalambous Dafninak, a 77 Elektronika Kft. munkatársainak. A kutatás létrejöttét a VEKOP-2_2_1-16-2017-00001, illetve a NKFI-6 124922 kódú pályázat támogatta. Köszönettel tartozunk Dr. Galajda Péternek és kutatócsoportjának a számunkra biztosított laboratóriumi eszközök használatáért.

Irodalom

[1] Dastider SG, Abdullah A, Jasim I, Yuksek NS, Dweik M, and Almasri M (2018) Rev. Sci. Instrum. 89: 125009

Nagy László
Fotoszintetikus reakciócentrum/grafén optoelektronika

P32

Fotoszintetikus reakciócentrum/grafén optoelektronika

Nagy László1, Radmila Panajotović,2 Jasna Vujin2, Tijana Tomašević-Ilić2, Ieva Bagdanavičiūtė3, Greta Urbonaitė3, Szabó Tibor1,4, Csekő Rihárd1, Váró György5 és Rinyu László4

1 Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Fizikai és Orvosi Informatikai Intézet

2 Institute of Physics, University of Belgrade, Belgrade, Serbia

3 Faculty of Natural Sciences, Vytautas Magnus University, Kaunas, Lithuania

4 MTA Atommag kutató intézet, Hertelendi Ede Környezetanalitikai Laboratórium

5 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

Fotoáramot mértünk fotoszintetikus reakciócentrum(RC)/grafén nanohibrid rendszerek gerjesztésével. A RC-ot Rhodobacter spheroides R-26 bíborbaktériumból tisztítottuk, és „liquid exfoliation” módszerrel üveglapra, vagy SiO2/Si felületre készített grafén rétegre szárítottuk. Fénnyel való gerjesztéssel fotoáramot tudtunk mérni mindkét kísérleti elrendezésben. Az üveglapra szárított minta lehetőséget adott arra, hogy elkülönítsük egymástól a fotoáram lokális hőmérséklet változása miatt bekövetkező megváltozását (amely a gerjesztéssel szükség szerint együtt jár) a grafén és a RC közötti elektronikus kölcsönhatás miatti megváltozástól. A SiO2/Si felületre készített minta egy lehetséges FET elrendezésben lehetőséget ad arra, hogy az elektromos térerő (Si és grafén közötti gate (G)) fotoáramra (grafén rétegen áthaladó IS-D) gyakorolt hatását megmutassuk a RC jelenlétében, illetve anélkül. Ezek az eredmények hasznos információt adhatnak egy szén (grafén) alapú nagy hatékonyságú, környezetbarát biohibrid bio-fotonikus rendszer megalkotásához.

Köszönetnyilvánítás

A munka a GINOP-2.3.2.-15-2016-00009 ‘IKER’, valamint az EFOP-3.6.2-16-2017-00005 “Ultragyors fizikai folyamatok atomokban, molekulákban, nanoszerkezetekben és biológiai rendszerekben” projekt támogatásával készült.

Elméleti biofizika

Aug 29 - csütörtök

8:30 – 9:40

Elnök: Dosztányi Zsuzsanna, Derényi Imre

08:30 – 08:45

Erdős Gábor
Szerkezet alapú partner predikció lineáris motívum kötő fehérjékhez

E34

Szerkezet alapú partner predikció lineáris motívum kötő fehérjékhez

Erdős Gábor1, Dosztányi Zsuzsanna1

1 MTA-ELTE Lendület Bioinformatikai kutatócsoport

A rövid lineáris motívumok a fehérjék kompakt funkcionális régiói, amelyek specifikus globuláris doménekhez kapcsolódnak. Az ilyen jellegű kölcsönhatások alapvetően fontosak a biológiai rendszerekben; részt vesznek tranziens fehérje komplexek kialakításában, a sejten belüli lokalizáció, vagy a fehérje sorsának meghatározásában.

Az LC8 egy lineáris motívumot kötő, rendkívül jól konzervált eukarióta homodimer fehérje. Elsőként a dynein motor komplex részeként írták le, ám mára több mint 60 új kötőpartnerét azonosították. Az eddig feltárt kölcsönhatások közül többnek ismert a szerkezete, és ezek nagyon hasonló kötési mechanizmust írnak le. A fontossága ellenére az LC8 fehérje pontos funkciója máig ismeretlen, és kölcsönhatási hálózata még csak részben feltárt.

A már ismert kötőpartnerek lehetőséget adnak szekvencia vagy szerkezeti alapú predikciós eljárások kidolgozására, amelyek alapján további partnerek azonosíthatóak, azonban a jelenlegi módszerek több szempontból is limitáltak. A szekvencián alapuló módszerek nem képesek arra, hogy új típusú kötőmotívumot azonosítsanak, a szerkezet alapú predikciós módszerek pedig nem működnek megfelelően lineáris motívumok esetében. Kutatásunk célja egy olyan módszer kifejlesztése, amely a kötődomén háromdimenziós szerkezete és kötőmechanizmusa alapján képes új kötőpartnerek azonosítására.

Az általunk kidolgozott módszer egy minden vizsgált rendszerre egyedi energiafüggvényen alapul, ami statisztikus potenciál alapján jellemzi a kölcsönhatást. A módszer lényege, hogy a Boltzmann statisztika alapján maximalizáljuk egy adott szerkezethez kötődő partnerek valószínűségét egy véletlenszerűen generált sokaságban. Eredményeink szerint a módszer képes jól kiválasztani az LC8 fehérje már ismert partnereit egy véletlen halmazból, anélkül hogy túl restriktív lenne új típusú motívumokkal szemben. Az energiafüggvény lehetőséget ad a molekuláris felismerésben fontos biofizikai tényezők felismerésében, és alkalmazható olyan rendszerekre is, amelyeknek szerkezete ismert, de a kötőmotívumát még nem írták le.

08:45 – 09:05

Hoffka Gyula
The role of conformational heterogeneity in the evolution of enzymes

E35

The role of conformational heterogeneity in the evolution of enzymes

Mónika Fuxreiter1, Gyula Hoffka1, Letif Mones2

1MTA-DE Laboratory of Protein Dynamics, Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Debrecen

2Department of Engineering, University of Cambridge

Designing artificial enzymes to catalyse reactions, which do not occur in Nature is a challenge for computational biology. The traditional procedure largely ignores protein motions, and exploits an interaction between a fixed quantum zone (QM) corresponding to the active site and a protein structure framework. The efficiency of such designs however, lags much behind that of natural enzymes. The only exception is the Kemp eliminase HG-3.17 [1], which has a catalytic activity comparable to the parent xylanase enzyme. We have employed multiscale QM/MM calculations to elucidate the molecular driving forces of the directed evolution process. Applying the Empirical Valence Bond [2] framework and the Free Energy Perturbation/Umbrella Sampling (FEP/US) method, we found that the reorganization energy is optimized throughout the development of HG-3.17 and enabled to suppress the promiscuous activities. Surprisingly, two conformers mutually play a role in optimization of the activity, and only the heterogeneous ensemble is capable to reproduce the experimental catalytic barriers. Determination of individual residue contributions highlighted the interplay between the different conformers and the optimization of the specific reaction. To our knowledge, this is the first example, where a conformationally heterogeneous system was involved in shaping enzymatic activity.

References

[1] R. Blomberg, H. Kries, D. M. Pinkas, P. R. Mittl, H. K. Privett, S. L. Mayo, D. Hilvert (2013) Nature, 503:418-421

[2] A. Warshel, R.M. Weiss, An empirical valence bond approach for comparing reactions in solutions and in enzymes, J. Am. Chem. Soc. (1980) 102: 6218–6226

09:05 – 09:20

Kiss Máté
Tissue hierarchies in plants can efficiently minimize somatic evolution and act as a functional germline

E36

Tissue hierarchies in plants can efficiently minimize somatic evolution and act as a functional germline

Kiss Máté1, Derényi Imre1 és Szöllősi Gergely János1

1 Eötvös Loránd Tudományegyetem Biológiai Fizikia Tanszék,

ELTE-MTA „Lendület” Evolúciós Genomika Kutatócsoport

Plant growth is governed by cell divisions in the apical meristems, which are tissues of undifferentiated cells in the shoot buds. The central zone of each meristem harbors a small group of slowly dividing stem cells. From time to time meristems also produce cells that give rise to leaves and a new meristem, called axillary meristem, in the axil of each leaf. These axillary meristems have the potential to turn into apical meristems and start to form new branches, but it is not a priori known which ones.

Recent studies have found surprisingly few genetic differences between distant branches of large plants which implies that plants can manage to keep the number of cell divisions along each lineage low (less than one per year), despite the large number of constantly produced stem cells of the axillary meristems and the inherently stochastic nature of the growth process.

To understand how plants can minimize somatic evolution, we developed a hierarchical meristematic tissue model and used computer simulations to find the optimal parameters that minimize the number of cell divisions along each lineage. We found that the optimal solution involves slow stem cell divisions in the apical meristems, and an exponentially increasing divisional rate of cells away from the central zone. New axillary meristems are produced from a few cells at the edges of apical meristems via cell divisions along a perfect binary tree.

While recent empirical evidence suggests a non-segregated functional germline in plants, it has been unclear how plants are able to produce the steady source of cells with low divisional numbers that are necessary to limit intergenerational mutation rates. Our results demonstrate that there exists an efficient mechanism, which renders germline segregation unnecessary, as the tissue hierarchies underlying plant growth are themselves able to minimize the accumulation of somatic mutations to sufficient extent.

Modern biofizikai módszerek

Aug 29 - csütörtök

9:50 – 11:40

Elnök: Vereb György, Lukács András

09:50 – 10:15

Szöllősi András
A Nematostella vectensis TRPM2 ioncsatorna krio-elektron mikroszkópos szerkezete

E37

A Nematostella vectensis TRPM2 ioncsatorna krio-elektron mikroszkópos szerkezete

Szöllősi András1, Zhang Zhe2, Tóth Balázs1, Chen Jue2 és Csanády László1

1Semmelweis Egyetem, Budapest; MTA-SE Lendület Ioncsatorna Kutatócsoport, Budapest

2Rockefeller Egyetem, New York, USA; Howard Hughes Medical Institute, USA

A „Transient Receptor Potential Melastatin 2”, rövidítve TRPM2, fehérje egy nemszelektív kation csatorna, amely számos élettani folyamatban fontos szerepet tölt be, ezek közül kiemelendő az immunválaszban, inzulin szekrécióban és az állandó testhőmérséklet szabályozásában játszott szerepe. A TRPM2 fehérje aktivátorai a citoszólikus Ca2+, foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát, valamint az ADP ribóz. Jelen előadásban a Nematostella vectensis csalánozóból izolált TRPM2 ioncsatorna (nvTRPM2) ~3 Å felbontás mellett meghatározott krio-elektron mikroszkópos szerkezetét mutatjuk be a Ca2+-kötött csukott konformációban. Rokon TRPM fehérjékkel összehasonlítva az nvTRPM2 fehérje szerkezete számos egyedi vonást tartalmaz, melyek segítenek jobban megérteni az ioncsatorna funkcionális jellegzetességeit. Az nvTRPM2 nagyobb Ca2+ iránti szelektivitása és ionáteresztő képessége jól magyarázható a negatív oldalláncokkal körbevett relatíve széles pórussal. A csatorna Ca2+ kötőhelye egy molekuláris alagúton keresztül a pórus alatti tágulatba torkollik, de emellett a citoszóllal is kapcsolatban van; ezen szerkezeti elemek ismeretében értelmezhetővé vált a csatorna markáns intra- és extracelluláris Ca2+-függése. A szelektáló filtert követő rövid helikális régió az nvTRPM2 tetramer szerkezetében nyolc negatív oldalláncot tartalmaz. A humán TRPM2 ioncsatorna azonos régiójában lévő töltetlen oldalláncok a csatorna már korábban megfigyelt gyors inaktivációját okozzák. Összességében tehát az itt bemutatott krio-elektron mikroszkópos szerkezet nagyban hozzájárul a TRPM2 ioncsatorna kapuzási mechanizmusának megértéséhez.

10:15 – 10:40

Lukács András
Fénnyel szabályozott adenilát-cikláz fotoaktivációjának vizsgálata ultragyors infravörös tranziens abszorpciós spektroszkópiai módszerekkel

E38

Fénnyel szabályozott adenilát-cikláz fotoaktivációjának vizsgálata ultragyors infravörös tranziens abszorpciós spektroszkópiai módszerekkel

Lukács András, Pirisi Katalin1, Jinnette Tolentino, James Iuliano, Peter J. Tonge2, Greg Greetham3, és Stepen R. Meech4

1 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai Intézet

2 Department of Chemistry, Stony Brook University, New York

3Rutherford Appleton Laboratory, Central Laser Facility

4University of East Anglia, School of Chemistry

Az OaPAC nevű fehérje egy fotoaktivált adenilát-cikláz (PAC), amely az Oscillatoria acuminata cianobaktériumban található [1]. Az adenilát-cikláz fényaktivációja egy BLUF (Blue light sensing using FAD) domén segítségével valósul meg, amelyben a fény hatására egy gyors átrendeződés következik be a flavin adenin dinukleotid körüli hidrogénkötés-rendszerben [2].

Kék foton elnyelését követően az OaPAC klasszikus BLUF fehérjeként viselkedik és a flavin abszorpciós maximumának közel 10 nm-es vörös eltolódását figyelhetjük meg. Ultragyors infravörös tranziens abszorpció segítségével megállapítottuk, hogy a fényabszorpciót követően egy a pikoszekundumos skálán megvalósuló elektron transzfer folyamatra kerül sor. Ennek az elektron transzfernek a fotoaktivációban betöltött szerepét vizsgáltuk több mesterséges fluoro-tirozinnak a segítségével [3]: attól függően, hogy hol helyezkedik el a fluor a a fluoro-tirozin fenolgyűrűjén úgy vátozik a mesterséges aminosav pK értéke.

Infravörös tranziens abszprció segítségével megállapítottuk, hogy a gerjesztést követően az OaPAC-ben proton kapcsolt elektron transzferre kerül sor, amely meghatározza az adenilát-cikláz fotoregulációját.

Köszönetnyilvánítás

EFOP-3.6.2-16

Irodalom

[1] Ohki M, et al. (2016) Structural insight into photoactivation of an adenylate cyclase from a photosynthetic cyanobacterium. Proc Natl Acad Sci USA 113:6659–6664

[2] Lukacs et al., (2014) BLUF Domain Function Does Not Require a Metastable Radical Intermediate State, (2014), J. Am. Chem. Soc.,136, 4605-4615

[3] Gil et al., (2017) Photoactivation of the BLUF protein PixD probed by the site-specific incorporation of fluorotyrosine residues. J. Am. Chem. Soc., 139, 14638– 14648,

10:40 – 11:00

Steinbach Gábor
Anizotróp szerkezetek leképezése újrapásztázó konfokális mikroszkóppal (RCM)

E39

Anizotróp szerkezetek leképezése újrapásztázó konfokális mikroszkóppal (RCM)

Steinbach Gábor1, Lucas Patty2, Nagy Dávid 1, Sipka Gábor 2, Erik Manders3, Garab Győző 2,4, Zimányi László

1 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

2 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Növénybiológiai Intézet

3 Confocal.nl

4 Biofotonika Kft.

Biológiai minták komplex molekuláris rendezett szerkezetének vizsgálata, bár a fénymikroszkópok limitált felbontóképessége miatt korlátozott, konfokális mikroszkópra épített differenciál-polarizációs mérési technikával (DP-LSM) feltérképezhető [1]. A közelmúltban sikerrel alkalmaztuk a DP mikroszkópiát rendezett növényi szerkezetek vizsgálatára [2]. Hasznos, ha a konfokális mikroszkópiában elérhető, a felbontóképességet növelő fejlesztéseket is igénybe véve kiterjesztjük a polarizált fénnyel való szerkezetvizsgálat hatókörét. Az újrapásztázó konfokális mikroszkóp (RCM) sCMOS kamerán alapuló leképezése 1,4-szeres laterális feloldóképesség javulást és kedvezőbb jel-zaj viszonyt biztosít a PMT-t használó LSM-ekhez képest, miközben megtartja a Z irányú felbontást [3].

A gerjesztőlézer polarizációját moduláló folyadékkristály (LC) alkalmazásával lehetővé válik a szerkezeti információk kinyerése, az FDLD leképezés elvégzése 2D-ben és 3D-ben. A moduláció és a képalkotás szinkronizálását egy külső programmal oldottuk meg, amely mind az eredeti Nikon szoftverrel, mint a LC vezérlővel tartja a kapcsolatot. A képfeldolgozási funkciókat MATLAB-ban elkészített, grafikus felületű program végzi [4].

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük a GINOP-2.3.2-15-2016-00001, a GINOP-2.3.2-15-2016-00003 és a GINOP-2.3.2-15-2016-00030 pályázatok pénzügyi támogatását.

Irodalom

[1] Steinbach G, Pawlak K, Pomozi I, Tóth EA, Molnár A, Matkó J, Garab G (2014) Methods and Applications in Fluorescence 2: 015005 (9pp)

[2] Radosavljević JS, Pristov JB, Mitrović AL, Steinbach G, Mouille G, Tufegdžić S, Maksimovic V, Mutavdžić D, Janoševic D, Vuković M, Garab G, Radotić K (2017) Cellulose, 24: 4653–4669

[3] de Luca GMR, Breedijk RMP, Brandt RAJ, Zeelenberg CHC, de Jong BE, Timmermans W, Azar LN, Hoebe RA, Stallinga S, Manders EMM (2013) Biomed Opt Express 4:2644-2656.

[4] Steinbach G, Nagy N, Sipka G, Manders E, Garab G, Zimanyi L (2019) European Biophysics Journal eprint https://doi.org/10.1007/s00249-019-01365-4

11:00 – 11:20

Nagy Krisztina
Antibiotikum- és fágresztencia evolúciója strukturált környezetben

E40

Antibiotikum- és fágresztencia evolúciója strukturált környezetben

Nagy Krisztina1, Phan Trung2, Dukic Barbara1, Ábrahám Ágnes1, Csákvári Eszter1, Austin Robert2 és Galajda Péter1

1 MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

2 Princeton University, Department of Physics

A baktériumokat természetes élőhelyeiken különféle környezeti hatások érik, melyek sok esetben kihívást jelentenek egy adott populáció túlélése szempontjából. Ezek a stresszfaktorok általában erősen heterogén térbeli eloszlást mutatnak. Egyes tanulmányok szerint a szelekciós nyomás ilyen inhomogén megjelenése nagymértékben felgyorsíthatja az egyébként lassú evolúciós folyamatokat.

Laboratóriumunkban azt vizsgáljuk, hogy a környezet térbeli strukturáltsága és kémiai heterogenitása hogyan befolyásolja baktériumközösségek ellenállóképességének evolúcióját antibiotikumokkal és bakteriofág vírusokkal szemben. A környezet összetettségét mikrofluidikai eszközökkel modelleztük. Kísérleteinkhez kétféle eszközt használtunk, egy komplexebb kamra- és csatornarendszert, amely nagyobb mozgásteret biztosít a baktériumok számára, és egy egyszerűbb, egyetlen lineáris kémiai gradienst előállító eszközt. E. coli populációk dinamikus térbeli eloszlását, növekedését követtük több napon keresztül fluoreszencia mikroszkópia segítségével.

Különböző hatásmechanizmusú antibiotikumok kémiai gradienseit teszteltük. Jellegzetes térbeli eloszlásokat figyeltünk meg, és kimutattuk, hogy a gradiens puszta jelenléte már 10-12 órán belül rezisztens sejtek megjelenését és elszaporodását okozza.

A T4r vírusokkal szemben rezisztens populációk körülbelül egy nap után jelentek meg. A strukturált környezet különböző pontjain biolfimszerű képletek indultak növekedésnek, amelyekből kiindulva a baktériumok később az eszköz más pontjait is benépesítették.

A kísérletek végén az eszközök felnyitásával a rezisztens törzsek további vizsgálatok céljából kinyerhetők. Teljes genom szekvenálással azonosítottuk a keletkező genetikai változásokat, mutációkat.

Köszönetnyilvánítás

A kutatás az NKFIH K 116516 és PD 124889 kutatási pályázatai, illetve a GINOP-2.3.2-15-2016-00001, a GINOP-2.3.2-15-2016-00026 és a GINOP-2.3.2-15-2016-00037 pályázatok támogatásával valósult meg.

11:20 – 11:40

Aranyos Attila
ForteBio BLI Systems for Versatile and Rapid Biomolecular Binding Kinetics and Quantitation

E41

Orvosi biofizika és sugárbiológia

Aug 29 - csütörtök

12:00 – 13:00

Elnök: Krizbai István, Csige István

12:00 – 12:15

Kis Dávid
Extracelluláris vezikulák szerepe rövid és hosszútávon a sugárzás szomszédsági hatásában

E42

Extracelluláris vezikulák szerepe rövid és hosszútávon a sugárzás szomszédsági hatásában

Kis Dávid, Persa Eszter, Szatmári Tünde, Sándor Nikolett, Hargitai Rita, Kis Enikő, Sáfrány Géza, Lumniczky Katalin

Nemzeti Népegészségügyi Központ, Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Főosztály, Sugárorvostani Osztály

Szomszédsági (bystander) sugárhatásnak nevezzük, ha olyan sejtekben is megnyilvánul sugárhatás, amelyeket közvetlen sugárzás nem ért. Az utóbbi években több in vitro kutatás is tudományosan bizonyította, hogy ez a hatás a sejtek közötti kommunikáció révén valósul meg. Azonban az erre irányuló komplexebb in vivo kutatások még hiányosak. Az extracelluláris vezikulák (EVk) olyan membránnal határolt struktúrák, amelyeknek a komplex tartalma (RNS, fehérje, lipid, DNS) alkalmassá teszi őket a sejtek közötti kommunikációra.

Kísérletünkben 9-12 hetes hím C57Bl/6 egereket egésztest besugárzás alá vetettünk 0; 0.1Gy; 0.25Gy és 2Gy dózisokkal. Az állatok csontvelőjét, lábcsontjait, lépét és máját az expozíciót követően 4 vagy 24 órával vagy 3 hónappal később vizsgáltuk. A csontvelőből EVt izoláltunk, melyeket analizáltunk és nem besugarazott, egészséges állatok farokvénájába oltottuk. Őket nevezzük bystander állatoknak. A bystander állatok csontvelőjét, lábcsontjait, lépét és máját EVk oltása után 4 vagy 24 órával vagy 3 hónappal később vizsgáltuk. A közvetlen besugárzást szenvedett és EVk oltásán átesett állatokban apoptózis, DNS károsodás, sejtfenotípusos és sejtszámbeli változásokat követtünk nyomon.

A besugarazott állatokból származó EVk hatását a bystander állatokban bekövetkező elváltozásokkal igazoltuk. Rövidtávú hatásként (4 vagy 24 órával a kezelés után) apoptózist mutattunk ki dózisfüggően heamatopoietikus őssejtekben (HSC) és limfoid progenitorokban. Csontvelőből migráló HSC-ket detektáltunk a lépben, és mezenchimális őssejteket (MSC) a csontszövetben. Csökkent a HSC és MSC populációk sejtszáma a csontvelőben. A HSC alpopulációi közül a multipotens progenitorok aránya szignifikánsan csökkent, mely hatás 3 hónappal később ugyan moderáltabban, de megnyilvánult. Hosszútávú hatásként (3 hónappal kezelés után) a limfoid progenitorok és granulocita-monocita progenitorok sejtszáma szignifikánsan csökkent dózisfüggően.

Összefoglalva, bizonyítottuk, hogy EVk rövid és hosszútávon is képesek a sugárzás szomszédsági hatását közvetíteni. Ez a vizsgálat segít megérteni a sugárzás közvetlen és szomszédsági hatásainak mechanizmusát a csontvelőben.

Támogatás: Euratom kutatási és oktatási program 2014-2018; 662287 számú pályázat.

12:15 – 12:30

Csige István
CO2 és radon gázok bőrön keresztüli felvétele mofettákban

E43

CO2 és radon gázok bőrön keresztüli felvétele mofettákban

Csige István1,2, Futó István1, Janovics Róbert1, Molnár Mihály1, Rinyu László1, Palcsu László1, Major István1, Turi Marianna1, Sóki Erzsébet12, Molnár József1, Gyila Sándor3

1 MTA Atomki, Izotóp Klimatológia és Környezetkutató (IKER) Központ, H-4026 Debrecen, Bem tér 18/c

2 DE TTK – MTA Atomki Környezetfizikai Kihelyezett Tanszék, H-4026 Debrecen, Bem tér 18/c

3 Dr. Benedek Géza Szívkórház, RO-525200 Kovászna, M. Eminescu u. 160, Románia

A szén-dioxidos fürdőterápia hatásmechanizmusára vonatkozóan viszonylag kevés irodalmi hivatkozás található, ezek is inkább csak hipotéziseket fogalmaznak meg. A hatásmechanizmus megismerése szempontjából lényeges lenne tudni, hogy a szén-dioxid kezelésnek kitett páciensek esetén milyen mértékű a szén-dioxid gáz bőrön át felszívódott mennyisége, hogyan függ ez a kezelés körülményeitől, a páciens állapotától, stb. Jelen projekt keretében demonstrálni kívántuk, hogy az MTA Atomki Környezetanalitikai Laboratórium stabilizotóp-arány mérésére szolgáló műszerhátterének alkalmazásával alkalmas módszer kifejlesztésével választ tudunk arra a kérdésre, hogy milyen sebességgel veszi fel a szervezet a bőrön keresztül a szén-dioxid gázt. A bőrön keresztüli CO2-felvétel meghatározásának elve, hogy a bőrön keresztül bejutó CO2 gáz 13C/12C izotóparánya lényegesen különbözik a szervezetben a normális életműködés során keletkezett CO2 gáz 13C/12C izotóparányától, és a kilélegzett levegőben a bőrön keresztül bejutott CO2 mennyiségétől függően meg kell változnia a 13C/12C izotóparánynak. A mátraderecskei mofettában jelentős, 100-200 kBqm-3-es nagyságrendben található radon gáz is. A bőrön keresztüli diffúziós, és az egész szervezetre kiterjesztett biokinetikai számítások szerint, speciális körülmények között, az így felvett radon gáz is kimutatható kell, hogy legyen a kilélegzett levegőben. Az elvégzett méréseink alapján becslést tudunk adni a CO2-felvétel sebességére, illetve felső korlátot a radonfelvétel sebességére a bőrön keresztül.

Köszönetnyilvánítás

A kutatást részben az Európai Unió és Magyarország az Európai Regionális Fejlesztési Alap társfinanszírozásában a GINOP-2.3.2-15-2016-00009 azonosítószámú ‘IKER’ pályázatban, részben a TÁMOP-4.2.6-15/1-2015-000 támogatta.

12:30 – 12:45

Gresits Iván
Mágneses nanorészecskéken alapuló rákterápia módszertanának vizsgálata és fejlesztése

E44

Mágneses nanorészecskéken alapuló rákterápia módszertanának vizsgálata és fejlesztése

Gresits Iván1,2., Thuróczy György1. Sági Olivér2., Homolya István2., Bagaméry Gergő3., Gajári Dávid3., Babos Magor3., Major Péter3., Márkus Bence Gábor3. és Simon Ferenc2.

1Nemzeti Népegészségügyi Központ, Nem-Ionizáló Sugárzások Osztálya,

2Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Fizika Tanszék;

3Mediso KFT

A mágneses nanorészecskék egyik fontos alkalmazási területe a daganatterápia egyik ága a termoterápia, melynek a lényege, hogy a nanorészecskéket a rákos sejtekhez juttatva, és aztán felmelegítve gyengíti vagy pusztítja a melegre amúgy is érzékenyebb tumorsejteket.

Kutatásunk célja egy olyan módszer kidolgozása, mellyel a nanorészecskék által a külső váltakozó mágneses térből elnyelt teljesítmény mérhető a testszövetben szonda közvetlen jelenléte nélkül is.

Az elnyelt teljesítmény mérésének a lényege, mérő rezgőkör jósági tényezőjét (Q) mérjük anyaggal és a nélkül. Az anyag elhangolja a rezgőkört, csökkenti annak Q-ját. Az elnyelt teljesítmény a két Q ismeretében határozható meg.

A méréseket egy MRI (Mágneses rezonancia alapú képalkotás) konzollal végeztük. A konzollal rövid pulzusokkal gerjesztjük a rezgőkört, és a pulzusok utáni lecsengést (tranziens) mérve Q lényegesen pontosabban határozható meg, mint egyéb módszerekkel (pl. frekvenciapásztázás – frequency sweep).

Irodalom

https://arxiv.org/abs/1904.02360

Gresits et al. Sci. Rep. 8, 12667 (2018))

12:45 – 13:00

Végh Attila Gergely
Neurovaszkuláris egység sejtes elemeinek rugalmasság térképezése gyulladásos mediátorok jelenlétében

E45

Neurovaszkuláris egység sejtes elemeinek rugalmasság térképezése gyulladásos mediátorok jelenlétében

Végh Attila Gergely, Molnár Kinga, Fazakas Csilla, Wilhelm Imola és Krizbai István

MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet

A központi idegrendszert érintő rosszindulatú sejtburjánzások többsége metasztatikus eredetű. Az áttétek kialakulásának és terjedésének komplex folyamata nem teljesen tisztázott. A rosszindulatú tumorok agyi áttétei igen rossz prognózissal és korlátozott terápiás lehetőséggel bírnak. A modern, tudományos alapokon nyugvó orvoslás ellenére, a központi idegrendszert érintő patológiás kórképek gyakran eredményeznek komoly életminőség-rontó neurológiai tüneteket. A központi idegrendszer homeosztázisának fenntartásában meghatározó szerepet tölt be a neurovaszkuláris egység. Az agyszövet sikeres kolonizációjában aktívan részt vesznek a tumor sejtek mikrokörnyezetének sejtes elemei melyek közül a periciták szerepe nem teljesen tisztázott. Ebben a soklépésű folyamatban a neurovaszkuláris egység kiemelt szerepet játszik, mely gyakran gyulladásos mediátorok jelenlétében sérülékenysége miatt csak részben képes megakadályozni a tumor sejtek bejutását az agyba. Az endotél sejtek és periciták mechanobiológiája, fokozott mechanikai igénybevételnek való kitettségük miatt, kiemelkedő jelentőséggel bír. Ezen jelenségek ok – okozati összefüggései nagyrészt feltáratlanok.

A neurovaszkuláris egységet alkotó sejtek közül agyi endotélsejtek valamint periciták gyulladásos mediátorok indukálta strukturális, morfológiai valamint nanomechanikai vizsgálatához kapcsolódó legfrissebb eredményeink kerülnek bemutatásra.

Köszönetnyilvánítás

Jelen mukát az OTKA FK128654, K116158, PD121130, FK124114, GINOP-2.3.2-15-2016-00001 programok támogatták. Wilhelm Imola munkáját az MTA Bolyai János Ösztöndíj programja (BO/00334/16/8) támogatta.